Undifilum oxytropis次級代謝產物GC-MS分析及抗腫瘤活性研究

劉忠艷，薛瑞旭，吳慶俠，董海龍，李　鵬，金藝鵬，林德貴（.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000；.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 700；.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 009）

Undifilum oxytropis次級代謝產物GC-MS分析及抗腫瘤活性研究

劉忠艷1，薛瑞旭2，吳慶俠1，董海龍1，李鵬3，金藝鵬3，林德貴3
（1.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100；3.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193）

研究瘋草內生真菌（Undifilum oxytropis），次級代謝產物成分與活性，通過GC-MS對菌絲體及發酵液進行了分析，并通過MTT法測定抗腫瘤活性。結果表明，菌絲體和發酵液中均以烷烴和酯類物質為主，菌絲體中檢出活性物質角鯊烯（0.863%）；菌絲體對HCT-8人回盲腸癌細胞和OS-RC-2人腎癌細胞抑制率均較高，發酵液對HCT-8人回盲腸癌細胞抑制率相對較弱。

瘋草；內生真菌；代謝產物；抗腫瘤

Corresponding authors：LI Peng；JIN Yi-peng

瘋草（locoweed）是一類含有毒性成分苦馬豆素（Swainsonine），并能引起動物出現典型神經癥狀和廣泛空泡變性的黃芪屬（Astragalus）和棘豆屬（Oxytropis）有毒植物的總稱，是世界范圍內分布最為廣泛、危害最為嚴重的毒草[1-2]。苦馬豆素屬吲哚里西啶類（indolizidine）生物堿，該類生物堿具有多樣的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抑菌等。2003年，國外學者Braun等從瘋草中分離到內生真菌，之后國內外學者相繼從瘋草中分離到內生真菌，并得到產苦馬豆素活性菌株，經鑒定為Undifilum spp.同時證明其與瘋草中苦馬豆素的產生存在一定關系[3-8]。

內生真菌已成為生物活性次級代謝產物的一個重要來源。內生真菌的多樣性、復雜性和特殊性的特點，使其產生的活性產物的結構類型遠遠超出它們的寄主植物，而且，內生真菌產生新穎化學結構的代謝產物的比例（51%）比土壤微生物（38%）要高很多，因此內生真菌也成為生物活性產物篩選熱點[9-10]。本文以Undifilum oxytropis為樣本，通過GC-MS分析次級代謝產物小極性段化學成分，同時通過MTT法研究其抗腫瘤活性，為其活性產物篩選奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料莖直黃芪內生真菌Undifilum oxytropis，由西北農林科技大學動物醫學院生物毒素與分子毒理試驗室提供。HCT-8人回盲腸癌細胞、OS-RC-2人腎癌細胞，由中國科學院細胞庫提供。

1.2次級代謝產物分析培養過濾得到的Undifilum oxytropis菌絲和濃縮發酵液采用乙醇熱回流法提取其代謝產物，制得浸膏懸浮于蒸餾水，后經石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分段萃取，分別得到各自萃取段。其中石油醚萃取段采用GC-MS進行分析。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-SMSI 5%Phe?nyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫60℃（保留2 min），以5℃/min升溫至310℃，保持10 min；運行時間：60 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間：3.0 min。

質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 294 V；接口溫度280℃；質量范圍29～500 amu。

1.3抗腫瘤活性研究HCT-8人回盲腸癌細胞、OS-RC-2人腎癌細胞接種于96微孔板，37℃、5% CO2培養至對數期。設3個平行組。陰性對照組添加細胞培養液200 μL，試驗I-VII組按38 μg/ μL、19 μg/μL、9.5 μg/μL、4.75 μg/μL、2.375 μg/ μL、1.188 μg/μL、0.594 μg/μL梯度濃度加入菌絲乙醇提取物，按170 μg/μL、85 μg/μL、42.5 μg/ μL、21.25 μg/μL、10.625 μg/μL、5.313 μg/μL、2.656 μg/μL梯度濃度加入發酵液乙醇提取物，培養36 h。分別加入0.5%MTT溶液20 μL培養4 h，棄去培養液加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩至甲臜紫色結晶溶解完全，酶標儀490 nm測其OD值。按下列公式計算癌細胞抑制率。

癌細胞抑制率=（1-給藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

2　結果

2.1GC-MS檢測結果按照上述條件對Undifilum oxytropis菌絲體和發酵液乙醚提取樣品進行分析，分別獲得其總離子流色譜圖（圖1和圖2），對色譜圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2008和Wiley275標準質譜圖，分別鑒定出菌絲體和發酵液樣品中的22個和28個化合物，未定化合物分別為5個和10個，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對百分含量，鑒定出的化合物分別占總提取物的88.580%和66.734%，結果見表1和表2。

圖1　Undifilum oxytropis菌絲體總離子流色譜圖

圖2　Undifilum oxytropis發酵液總離子流色譜圖

表1　菌絲體石油醚萃取段GC-MS檢測結果

Undifilum oxytropis菌絲體中油酸（39.82%）、油酸甲酯（21.531%）、棕櫚酸（10.336%）、棕櫚酸甲酯（5.306%）等含量較高，發酵液中則以苯二甲酸丁酯（40.643）含量最高。菌絲體和發酵液中均以烷烴和酯類物質為主，同時菌絲體中還檢測到活性物質角鯊烯，其含量為0.863%。

2.2抗腫瘤活性研究Undifilum oxytropis菌絲體乙醇提取物對HCT-8、OS-RC-2均有較強的抑制作用，其半數抑制濃度分別為9.5 μg/μL和2.375 μg/ μL，發酵液乙醇提取物對OS-RC-2抑制作用較強，半數抑制濃度為42.5 μg/μL，對HCT-8則相對較弱，半數抑制濃度為170 μg/μL。結果見圖3。

表2　發酵液石油醚萃取段GC-MS檢測結果

圖3　UNDIFILUMOXYTROPIS菌絲體與發酵液腫瘤細胞抑制曲線

3　討論

本文從Undifilum oxytropis菌絲體和發酵液中檢出化合物均以烷烴類和酯類化合物為主，同時含有少量的揮發性酸，菌絲體檢出化合物種類低于發酵液中化合物檢出種類。從菌絲體中檢測到的角鯊烯具有促進動物機體組織攜氧、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抑制微生物生長等能力[11]。王建軍[12]還首次從瘋草植物莖直黃芪中分離得到角鯊烯，可以推測其產生也可能與Undifilum內生菌有關。從發酵液中檢測出的異黃蝶呤常被用作腫瘤標志代謝物進行研究，其具有抗腫瘤、抗突變等作用[13-14]。

Undifilum oxytropis菌絲體和發酵液均具有明顯的抑制腫瘤活性，且抗腫瘤活性物質主要分布于菌絲體中。因瘋草中活性成分吲哚里西啶類生物堿主要為大極性物質，因此其抗腫瘤活性是否完全與苦馬豆素有關還需對其次級代謝產物大極性段進行研究。

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GC-MS and antitumor activity study on thesecondary metabolites ofUndifilum oxytropis

LIU Zhong-yan1，XUE Rui-xu2，WU Qing-xia1，DONG Hai-long1，LI Peng3，JIN Yi-peng3，LIN De-gui3
（1.Tibet Agriculture and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China；2.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；3.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to study the active ingredients of secondary metabolites in locoweed endophyte，Undifilum oxytropis，the mycelium and fermentation broth were analyzed by GC-MS，and antitumor activity was measured by MTT assay.It showed that：al?kanes and esters were mainly active substances in both mycelium and fermentation broth.And squalene（0.863%）was detected in the mycelium；HCT-8 human ileocecal cancer and OS-RC-2 human renal cancer were highly inhibited by the mycelium.Inhibi?tion rate of fermentation broth to HCT-8 human ileocecal cancer was relatively weak.

locoweed；endophyte；metabolites；antitumor

S856.9

A

0529-6005（2016）07-0019-03

2016-02-23

中國農業大學基本科研業務經費專項資金（2015-TC027）；西藏自治區科技廳自然科學基金（2015ZR-13-31）

劉忠艷（1982-），男，講師，碩士，主要從事動物中毒性與營養代謝性疾病研究，E-mail：yjkdhqc@163.com

李鵬，E-mail：Vetli@cau.edu.cn；金藝鵬，E-mail：yipengjin@sina.com