鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒雙重PCR檢測方法的建立

趙　麗，盧婷婷，李存法，陳忠杰，連瑞麗

（河南牧業(yè)經濟學院，河南 鄭州 450011）

鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒雙重PCR檢測方法的建立

趙麗，盧婷婷，李存法，陳忠杰，連瑞麗

（河南牧業(yè)經濟學院，河南 鄭州 450011）

依據基因庫中的豬偽狂犬病病毒（PRV）基因序列，分別設計了gE和gH兩對引物，以PRV閩A株、Bartha （gE-）株和Norden（Tk-）株為模板，篩選最佳反應條件，建立了檢測豬偽狂犬病病毒野毒株與疫苗毒株的鑒別PCR方法。該方法能從PRV閩A株、Norden（Tk-）株中擴增出一條355 bp的條帶，但Bartha（gE-）株沒有擴增出該目的條帶。對正常細胞、豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）進行檢測，結果均為陰性，沒有出現交叉反應。在對單項PCR反應條件（引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度等）優(yōu)化的基礎上，建立了鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒的雙重PCR檢測方法，并分別用雙重PCR和單項PCR檢測15份臨床病料，兩者符合率為97.5%，表明該雙重PCR檢測方法有較高的敏感度，可以用于臨床病料的檢測。

雙重PCR；偽狂犬病病毒；野毒和疫苗毒；鑒別診斷

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是多種家畜和野生動物均可感染的一種皰疹病毒，常引起母豬出現繁殖障礙及初生仔豬大批死亡，成年豬則長期帶毒排毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經濟損失。近幾年養(yǎng)殖場豬偽狂犬病又有上升趨勢，控制和消滅偽狂犬病所面臨的主要困難是確定偽狂犬病病毒的潛伏感染、野毒感染或疫苗感染，豬在初次感染康復后往往長期帶毒，當機體受到內外因素刺激時，病毒被激活并持續(xù)排毒[1-4]，引起疫病的擴散。疫苗免疫接種和疾病的早期鑒別診斷是有效防制和根除偽狂犬病的根本措施。目前常用的方法就是PCR擴增，快速、特異，因此，有必要建立一種快速、早期并能同時確定是疫苗株感染還是野毒株感染的雙重PCR檢測方法[5-7]。

gH基因是偽狂犬病病毒中較保守和病毒復制所必需的基因；gE基因是偽狂犬病病毒的毒力基因也是常用的基因缺失疫苗的缺失基因。以gH、gE基因序列作為靶序列建立的PCR技術，能夠區(qū)分基因缺失疫苗接種與野毒感染[6]。因此本研究根據豬偽狂犬病病毒gH、gE基因序列設計兩對引物，建立了鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒的雙重PCR方法。

1　材料與方法

1.1毒株與菌種PRV閩A（Fa）株、Norden（Tk-）株和Bartha（gE-）株、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細小病毒（PPV），由河南省動物性食品安全重點實驗室保存；PRVg基因E缺失疫苗，購自武漢科前生物制品有限公司。工程菌JM109感受態(tài)細胞為寶生物工程（大連）有限公司產品；病料采自河南周邊豬場。

1.2質粒工具酶及其他化學試劑EX TaqDNA聚合酶為北京康為生物工程有限公司產品；異硫氰酸胍（GuSCN）、重蒸飽和酚、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、2.5 mmol/L dNTP；2 000 bp DNA lad?der、200 bp DNA ladder、DNA凝膠回收試劑盒、溴化已錠（EB）、溴酚蘭等均為北京康為世紀生物科技有限公司產品；瓊脂糖（Agarose）：Promega公司產品。

1.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱、PCR儀、紫外微量分光光度計，購自美國Thermo Forma公司；DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀、電泳槽：北京六一儀器廠；超速冷凍離心機：SIGMA公司；紫外凝膠成像系統：Alpha Innotech公司。

1.4方法

1.4.1引物的設計與合成利用DNAStar（Ver?sion5.0）軟件進行同源性分析，應用Primer Pre?mier5.0軟件設計出擴增gH基因355 bp和gE基因139 bp的幾對特異引物

gH：上游引物（P1）：5′-ACGGAAGTTATA?AGGATGA-3′；

下游引物（P2）：5′-TGTCTCCGAAGAAATAA?GA-3′；

gE：上游引物（P3）：5′-ACGGAAGTTATA?AGGATGA-3′；

下游引物（P4）：5′-TGTCTCCGAAGAAATAA?GA-3′。

兩對引物均由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.4.2PRV病毒培養(yǎng)及模板DNA的制備用PK15細胞培養(yǎng)偽狂犬病病毒株，在細胞病變達75%以上時收獲細胞，反復凍融3次，置-20℃保存?zhèn)溆谩２《綝NA及臨床樣品模板DNA制備參照[8]。

1.4.3偽狂犬病病毒gH、gE基因單一PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

1.4.3.1偽狂犬病病毒gH、gE基因PCR檢測方法的建立按如下體系進行PCR擴增：

反應條件94℃變性3 min后，進人循環(huán)94℃30 s，56℃（gH）和54℃（gE）30 s，72℃30 s，25個循環(huán)后，72℃延伸5 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進行電泳檢測。

1.4.3.2gH、gE基因單一PCR反應條件的優(yōu)化

對gH、gE基因單一PCR反應參數包括引物、Taq酶、dNTPs、Mg2+濃度及退火溫度、時間、循環(huán)次數等進行優(yōu)化，建立兩種基因的單聯PCR最佳反應體系。

1.4.4單一PCR檢測方法的特異性試驗分別提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株和Norden（Tk-）株、PRV gE基因缺失疫苗和PPV、PCV等病毒DNA，分別進行PCR擴增，并設立陰性對照，以檢測該單一PCR檢測方法的特異性。

1.4.5單一PCR檢測方法的敏感性測定提取PRV Fa毒株DNA，測定其含量后，將其核酸依次作10倍的梯度稀釋，采用己優(yōu)化好的PCR反應體系進行PCR擴增，以檢測其敏感性。

1.4.6gH、gE基因雙重PCR檢測方法的建立在50 μL體系中加入以下成份：

瞬時離心后于PCR儀上94℃預變性5 min后，94℃30 s；56℃30 s；72℃1 min，30個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。同時設立無模板的陰性對照。反應結束后，取5 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進行電泳檢測PCR結果。

1.4.6.1雙重PCR反應體系的優(yōu)化（1）雙重PCR的引物濃度的優(yōu)化：gH、gE基因分別以50 pmol/μL的引物濃度0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、1 μL進行雙重PCR反應，以選取兩種病毒的最佳引物濃度；（2）雙重PCR的退火溫度的優(yōu)化：gH、gE基因分別以52℃、54℃、56℃、58℃的退火溫度進行雙重PCR反應，以確定最佳的退火溫度；（3）雙重PCR檢測方法的特異性試驗：分別提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株和Norden（Tk-）株的DNA，加入己優(yōu)化好的雙重PCR體系中進行擴增，并以PPV、PCV及正常PK15細胞作為陰性對照，以檢測該雙重PCR檢測方法的特異性；（4）雙重PCR檢測方法的敏感性試驗：參照[8]，超速離心純化PRV Fa株病毒及gH、gE基因的DNA，10倍的梯度稀釋并測定其病毒滴度，采用己優(yōu)化好的雙重PCR體系進行擴增，以檢測其敏感性。

1.4.6.2對病料進行復合PCR檢測對采自河南不同地區(qū)的豬偽狂犬病疑似病料進行雙重PCR檢測。

2　結果與分析

2.1單一PCR優(yōu)化檢測方法的擴增結果提取PRV Fa的標準強毒株DNA，進行單一的PCR優(yōu)化擴增反應。其電泳結果顯示，PCR擴增出一條約355 bp和139 bp目的DNA片段，與預期大小相當（圖1、圖2），PCR產物純化回收后測序表明，所擴增序與參照的PRV核酸序列同源性為100%，證明PCR產物為預期擴增的目的DNA片段。

2.2單一PCR檢測方法的特異性分析用gH、gE基因特異性的引物分別對PRV Fa株、Bartha株、Norden株進行擴增，并將豬常見的繁殖障礙性疾病病原PPV、PCV和正常PK15細胞作為陰性對照，進行PCR擴增。結果如圖3、圖4。

圖1　PRVgH基因PCR擴增結果

圖2　PRVgE基因PCR擴增結果

圖3　PRVgH PCR特異性測定

圖4　PRVgE PCR特異性測定

PRV的所有毒株均可以擴增出355 bp的片段，PRV Fa株和Norden株可以擴增出139 bp的片段，而陰性對照樣品均未能擴增出任何條帶。

2.3單一PCR檢測方法的敏感性測定結果將提取的PRV Fa株的DNA按照病毒滴度作梯度稀釋，以優(yōu)化好的單一PCR反應體系進行PCR擴增，其結果如圖5。

圖5　PCR檢測PRVgH模板DNA的敏感性

圖6　PCR檢測PRVgE模板DNA的敏感性

gH基因的單一PCR方法最低可檢測到大約為10 TCID50/100 μL的病毒DNA；gE基因的單一PCR方法最低可檢測到大約為9.5 TCID50/100 μL的病毒DNA。

2.4雙重PCR檢測方法的擴增結果提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株的DNA后，進行雙重PCR擴增反應，其結果如圖7。

圖7　雙重PCR反應擴增的結果

從圖7可看出，雙重PCR可擴增出PRV gH基因355 bp和gE基因139 bp的條帶，證明該雙重PCR可同時擴增PRV gH基因和gE基因從而鑒別野毒與疫苗毒感染。

2.5雙重PCR反應體系的優(yōu)化結果

2.5.1引物濃度的優(yōu)化將PRV gH、gE基因分別以50 pmol/μL，30 pmol/μL，20 pmol/μL，10 pmol/ μL的引物濃度進行雙重PCR反應，結果顯示，gH基因的最佳引物濃度為20 pmol/μL，gE基因的最佳引物濃度為20 pmol/μL。

2.5.2雙重PCR退火溫度的優(yōu)化將PRV gH、gE基因分別以52℃、54℃、56℃、58℃的退火溫度進行雙重PCR反應，在退火溫度為56℃時擴增結果均清晰無雜帶。

2.6雙重PCR方法特異性試驗結果分別應用gH、gE基因的特異性引物，以優(yōu)化好的雙重PCR體系，對PRV Fa、Bartha株、Norden株、gE基因缺失疫苗株以及對照樣品進行雙重PCR擴增，其擴增結果如圖8。

圖8　雙重PCR方法特異性結果

由圖8可以看出，PRV Fa株、Norden株均出現355 bp和139 bp特異性條帶，而Bartha株和gE基因缺失疫苗株只出現355 bp條帶，對照樣品則呈陰性，說明了該雙重PCR反應良好的特異性。

2.7雙重PCR方法敏感性測定結果將提取PRV gH、gE基因的DNA按照其病毒滴度進行系列稀釋，利用己優(yōu)化好的雙重PCR反應體系進行雙重PCR擴增，其結果如圖9。該二聯PCR最低能檢測到10-4稀釋PRV即gH 100 TCID50/100 μL，gE 95 TCID50/100 μL的核酸模板。

2.8重復性試驗結果重復檢測PRV的樣品3次，結果均一致。

2.9雙重PCR病料檢測結果對15份來自河南周邊地區(qū)PRV疑似病料檢測，其中有5份雙重PCR檢測gH基因為陽性；有3份雙重PCR檢測gH、gE基因同時為陽性；其余病料復合PCR檢測全為陰性，在同樣條件處理下的健康豬材料為陰性，結果與單項PCR檢測結果符合率達97.5%。

圖9　雙重PCR方法敏感性測定結果

3　結論與討論

3.1PCR技術具有快速和靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但常規(guī)的PCR技術一次檢測不能區(qū)分出疫苗毒還是野毒感染。本研究根據偽狂犬病病毒PRV基因缺失疫苗缺失了gE基因和病毒必需基因gH的特點，按照PRV gE和gH的序列設計兩對引物，建立了特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好，能區(qū)分gE基因缺失疫苗毒和野毒的PCR鑒別診斷方法。該方法同時能用于潛伏感染病毒的檢測，可區(qū)分開野毒潛伏感染與疫苗毒潛伏感染。復合PCR反應是一種特殊的PCR形式，當其反應體系中同時含有兩對或兩對以上引物和模板時，反應總是有利于片段較小的一方，即短片段優(yōu)先擴增的原理[2]。但是本試驗gE雖然是短片段但并沒有優(yōu)先擴增，這可能與模板量差異以及毒株差異有密切關系。gE基因G+C%含量高達74.4%，開始時用一般的10×Buffer擴增不出特異性條帶，后來換成2×GC BufferII后得到很好擴增。本試驗所擴增的PRV gH、gE片段為355 bp和139 bp，兩者相差不大，在選擇反應條件時，盡量選擇有利于gE基因的擴增條件，以達到最佳的復合PCR擴增效果。

3.2本試驗在單項PCR條件的基礎上作出了復合PCR反應條件的選擇。在引物濃度的選擇上，考慮到gE基因難擴增，所以選擇兩者單項PCR擴增均較好的引物濃度。在溫度循環(huán)參數中，由于兩種PCR反應的變性和延伸條件相同，故沒作改變。復性溫度gH基因在54℃、56℃擴增效果較好，而gE基因在54℃、56℃、58℃均能得到很好擴增，故復合PCR的復性溫度選擇在56℃。從PRV雙重PCR的敏感性測定結果表明，在雙重PCR反應中，只要引物設計合理，反應條件選擇得當，雙重PCR擴增和常規(guī)PCR技術一樣，都具有極高的敏感性，能檢出痕量目的DNA片段。

3.3對15份臨床病例檢測結果表明，5份gH基因檢測陽性為使用了偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗，3份gH、gE基因同時為陽性為偽狂犬病病毒野毒感染，由此可見，應用PRV的雙重PCR技術可以直接對臨床樣品進行擴增，可區(qū)分野毒和疫苗毒，大大提高了PRV的診斷速度，這對PRV的早期診斷及區(qū)分疫苗毒和野毒臨床的快速鑒別診斷具有很高的實用價值。

[1]Yoon H A，Eo S K，Aleyas A G，et al.Investigation of pseudora?bies virus latency in nervous tissues of seropositive pigs exposed to field strain[J].Vet Med Sci，2006，68（2）：143-148.

[2]Yoon H A，Eo S K，Aleyas A G，et al.Molecular survey of latent pseudorabies virus infection in nervous tissues of slaughtered pigs by nested and real-time PCR[J].Microbiol，2005，43（5）：430-436.

[3]Tanaka S，Mannen K.Effect of mild stress in mice latently infect?ed pseudorabies virus[J].Exp Anim，2003，52（5）：383-386.

[4]Jin L，Schnitzlein W M，Scherba G.Identification of the pseudorabies virus promoter required for latency-associated transcript gene ex?pression in the natural host[J].Virology，2000，74（14）：6333-6338.

[5]Palladino S，Kay I，Fonte R.Use of real-time PCR and the light cycler system for the rapid detection of Pneumocystis carina in re?spiratory specimens[J].Diagn Microbiol infect Dis，2001，39（4）：233-236.

[6]周斌，蘇鑫銘，張素芳，等.PCR快速檢測偽狂犬病病毒野毒感染[J].中國病毒學，2004，19：612-615.

[7]趙麗，崔保安，方忠意，等.PCR檢測豬偽狂犬病病毒方法的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（2）：142 146.

S852.65

A

0529-6005（2016）07-0012-04

2015-11-16

河南省重點科技攻關項目（152102110092）

趙麗（1973-），女，副教授，博士生，研究方向為分子病毒學與免疫學，E-mail：zhaolisq@163.com