兩種不同給藥計算方法對體外藥效實驗結果的影響

楊成芳, 李　麗, 李勇文, 鐘毓娟, 熊美麗, 方舒萍

(桂林醫學院 藥學院, 廣西 桂林　541004)

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兩種不同給藥計算方法對體外藥效實驗結果的影響

楊成芳, 李麗, 李勇文, 鐘毓娟, 熊美麗, 方舒萍

(桂林醫學院 藥學院, 廣西 桂林541004)

目的:研究按濃度與按單個細胞藥物含量兩種不同計算方法對甲基阿魏酸(methyl ferulic acid,MFA)抑制TGF-β1刺激的體外培養人肝星狀細胞(HSC-LX2)α-SMA表達的影響,評價兩種給藥計算方法在細胞實驗中的應用效果。方法:體外培養HSC-LX2,MTT法測定MFA抑制HSC-LX2增殖的作用,由此確定MFA 1.25 、2.5、5 mg/L(其相應的單個細胞MFA含量為1.13×10-7、2.25×10-7和4.5×10-7mg)3個濃度進行后續的實驗；以兩種不同的細胞數量接種到培養皿,分別以上述濃度和單個細胞MFA含量干預72 h,采用RT-PCR檢測細胞α-SMA mRNA的表達和Western blotting檢測細胞內α-SMA蛋白含量。結果:在兩種不同細胞數量情況下,以單個細胞MFA含量計算方法干預后,相同MFA含量組α-SMA mRNA和蛋白的表達趨勢一致,且與MTT結果相吻合；而以濃度計算方法干預后,相同MFA濃度組α-SMA mRNA和蛋白表達差異較大。結論:以單個細胞藥物含量計算方法在MFA對HSC-LX2細胞體外藥效實驗中的應用效果更穩定,更科學,實驗可重復性較好。

細胞實驗； 給藥計算方法； 藥物效應； 甲基阿魏酸

藥物劑量與藥物效應有著密切的關系,兩者在一定范圍內成比例,劑量變化后會產生劑量相關靶的激活,隨之藥物的作用會發生質或量的變化[1]。所以在評價藥物效應的實驗中,藥物劑量的作用是不容忽視的。目前在細胞實驗中最常用的給藥計算方法有按質量分數、體積分數和摩爾濃度等。課題組前期研究發現,甲基阿魏酸抑制HSC-LX2增殖與活化細胞實驗按濃度給藥方式得出的實驗結果會隨著接種到培養皿的細胞數量的變化而變化,同時,結合動物實驗給藥方式的選擇——按體重或者按體表面積計算,作者認為藥物效應與單個細胞藥物含量有關。因而,本研究分別按質量濃度和單個細胞藥物含量兩種給藥計算方法進行藥物干預,觀察不同細胞數量情況下兩種給藥計算方法對實驗結果的影響,探討一種更實用、更科學的細胞實驗的給藥計算方法。

1　材料與儀器

細胞來源:人肝星狀細胞株(HSC-LX2),BioHermes。

藥物與試劑:甲基阿魏酸(MFA),化學名為3,4-二甲氧基肉桂酸(sigma公司,批號:101236152)；高糖DMEM培養基、胎牛血清,Hyclone；TGF-β1,novoprotein,批號PO1137；RNApure高純總RNA快速提取試劑盒,北京艾德萊生物,批號130127；TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒,TIANGEN,批號RT120420；2×Taq PCR Master Mix 北京艾德萊生物,批號KT201-01；鼠抗人GAPDH /α-SMA單克隆抗體,Aidlab ；Biotech- nologies； HRP 標記兔抗鼠二抗,北京中杉金橋生物技術有限公司。

主要儀器:CO2培養箱(美國Thermo,Model 311)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf,5804R)；多通道PCR 儀(美國MJ公司,PTC-220)；核酸蛋白測定儀( 日本島津)；倒置相差顯微鏡(德國蔡司產品)；DYY-6D凝膠電泳儀/電泳槽(北京賽因坦科技有限公司),培清JS-780全自動凝膠成像分析系統(上海培清科技),蛋白電泳儀/電轉膜儀—JY600C(上海生工)。

2　實驗方法

2.1細胞培養

人肝星狀細胞系HSC-LX2,置于含10%胎牛血清、100 U / mL青霉素和100 nmol/L鏈霉素的高糖DMEM培養液中,37 ℃、5%CO2條件下培養,隔天換液,待細胞長至80%密度時,用0.25%EDTA胰蛋白酶消化,每2～3 d傳代1次,每次實驗均取呈指數生長的細胞進行。

2.2MTT法檢測MFA對TGF-β1刺激的HSC-LX2增殖的影響

MTT操作步驟參照文獻[2-4]方法進行。模型組僅含終質量濃度為1 μg/L的TGF-β1刺激,各藥物組含終質量濃度為1 μg/L的TGF-β1和終質量濃度分別為0.312、0.625、1.25、2.50、5、10、20、40 mg/L的MFA,計算細胞增殖抑制率,由此確定后續實驗的藥物濃度和單個細胞藥物含量。

2.3實驗分組及給藥

將HSC-LX2細胞接種于φ為10 cm的培養皿,每個培養皿細胞數分別為5×104和10×104個,各16皿。實驗設立正常對照組、TGF-β1刺激的模型組、按濃度為1.25、2.5、5 mg/L組和按單個細胞MFA含量為1.13×10-7、2.25×10-7、4.5×10-7mg組。細胞貼壁良好后,除空白對照組外,模型組加入終質量濃度為1 μg/L的 TGF-β1刺激,各給藥組加入終質量濃度為1 μg/L的 TGF-β1含各濃度藥液10 mL的培養液,繼續培養72 h。采用Trizol法抽提細胞中總RNA和低溫提取細胞中總蛋白。

2.4RT-PCR檢測HSC-LX2細胞α-SMA mRNA的表達

RT-PCR法參照文獻[3-4]進行。用Primer Premier 5.0自行設計引物,引物序列見表1。PCR反應參數:94℃預變性3 min ；94 ℃變性30 s；53 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min；共35個循環。反應結束后取10 μL RT-PCR產物及8 μL DNA marker進行2%瓊脂糖凝膠電泳, 結果經全自動凝膠成像分析系統進行分析,樣本α-SMA mRNA PCR產物條帶的光密度與內參β-actin mRNA PCR產物條帶的光密度(OD)比值作半定量分析。重復3次,取平均值進行統計分析。

表1　α-SMA和 β-actin的上下游引物序列

2.5Western blotting檢測細胞內α-SMA蛋白含量

Western blotting參照文獻[5-6]進行。所得膠片經全自動凝膠成像分析系統進行灰度值分析。重復3次,取平均值進行統計分析。

2.6統計分析

3　結果

3.1MFA對HSC-LX2細胞增值的影響

如圖1所示：當MFA質量濃度在0.31～5.0 mg/L之間時,MFA對HSC-LX2的增殖抑制作用與MFA濃度成正相關；在5.0～40.0 mg/L之間時成負相關；MFA在5 mg/L對HSC-LX2的增殖抑制作用最大。故選用濃度較小、抑制作用較大的1.25、2.5、5 mg/L(其相應的單個細胞MFA含量分別為1.13×10-7、2.25×10-7、4.5×10-7mg)3個濃度進行后續實驗。

圖1　MFA對HSC-LX2細胞增值的影響(n=3)

3.2兩種不同給藥計算方法對MFA抑制細胞α-SMA mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示, 按濃度給予MFA干預72 h后,接種至培養皿的細胞數為5×104時,與模型組比較,MFA 2.5 mg/L組抑制α-SMA mRNA的表達效果最好(P<0.01),而1.25 mg/L和5 mg/L兩組的效果相當(P<0.05)；在細胞數為10×104時,與模型組比較,1.25 mg/L組無顯著性差異,而2.5 mg/L和5 mg/L兩組有顯著差異(P<0.01),(見圖2和表2)。按單個細胞MFA含量給藥72 h后,兩種不同細胞數量情況下,各個相同MFA含量組α-SMA mRNA表達趨勢一致,如表3和圖3所示,與模型組比較,2.25×10-7、4.5×10-7mg/個兩組有顯著差異(P<0.01),1.13×10-7mg/個組無統計學差異。

圖2　按MFA濃度給藥對細胞α-SMA mRNA表達的影響

組別質量濃度mg·L-1α-SMA/β-actin接種細胞數為5×104接種細胞數為10×104正常對照組—0.298±0.0240.355±0.051模型組—0.802±0.080**0.708±0.087**甲基阿魏酸1.250.687±0.077△0.623±0.077甲基阿魏酸2.50.208±0.019△△0.241±0.037△△甲基阿魏酸5.00.657±0.071△0.141±0.023△△

注:與正常對照組比較,**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

表3　按單個細胞MFA含量給藥對細胞α-SMA mRNA表達的影響

注:與正常對照組比較,**P<0.01；與模型組比較,△△P<0.01。

圖3　按單個細胞MFA含理對細胞α-SMA mRNA表達的影響

3.3兩種不同給藥計算方法對MFA抑制細胞α-SMA蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示, 按濃度給予MFA干預72 h后,接種至培養皿的細胞數為5×104時,與模型組比較,MFA 2.5 mg/L組抑制α-SMA 蛋白的表達效果最好(P<0.01),而1.25 mg/L和5 mg/L兩組的效果相當(P<0.05)；在細胞數為10×104時,與模型組比較,1.25 mg/L組無顯著性差異,而2.5 mg/L和5 mg/L兩組有顯著性差異(P<0.01),見圖4和表4。按單個細胞MFA含量給藥72 h后,兩種不同細胞數量情況下,各個相同MFA含量組α-SMA 蛋白表達趨勢一致,如圖5和表5所示,與模型組比較,2.25×10-7mg/個和4.5×10-7mg/個兩組呈顯著差異(P<0.01),1.13×10-7mg/個組無統計學差異。

圖4　不同細胞數按MFA濃度給藥對細胞α-SMA 蛋白表達的影響

組別質量濃度mg·L-1α-SMA/GAPDH接種細胞數為5×104接種細胞數為10×104正常對照組—0.388±0.0340.325±0.043模型組—0.966±0.098**0.833±0.068**甲基阿魏酸1.250.812±0.078△0.762±0.069甲基阿魏酸2.50.288±0.021△△0.406±0.044△△甲基阿魏酸5.00.804±0.080△0.351±0.035△△

注:與正常對照組比較,**P<0.01；與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

表5　按單個細胞MFA含量給藥對細胞α-SMA蛋白表達的影響

注:與正常對照組比較,**P<0.01；與模型組比較,△△P<0.01。

4　討論

目前多數學者認為抑制HSCs的活化與增殖是治療肝纖維化的最重要的策略[7-8],逆轉肝纖維化關鍵在于減少活化的HSCs數量[9-10]。HSCs活化時具有高度增殖活性和轉化為高表達α-SMA的肌成纖維細胞,合成大量細胞外基質；反之,α-SMA又可誘導HSC的增殖、活化,表達更多的α-SMA,故α-SMA的表達被認為是HSC活化的顯著特征之一[11]。因此,本實驗擬用α-SMA mRNA與蛋白的表達情況作為評判MFA抑制HSC-LX2增殖與活化的效應指標。

圖5　不同細胞數按單個細胞MFA含量給藥對細胞α-SMA 蛋白表達的影響

在細胞實驗中,藥物效應是藥物分子與細胞之間直接的相互作用,細胞原有功能水平的改變,與細胞密度、細胞上受體位點的多少及親和力及細胞所處的微環境等有關[12]。本研究的RT-PCR與Western blotting 實驗結果均顯示:在接種至培養皿的細胞數量不同的情況下,按MFA濃度給藥干預后,相同的MFA濃度組細胞α-SMA的表達差異較大,比如細胞數為5×104時,與模型組比較,MFA 2.5 mg/L組抑制α-SMA 的表達效果最好(P<0.01),而另外兩組的效果相當(P<0.05),但是在細胞數為10×104時,與模型組比較,1.25 mg/L組無顯著性差異,而2.5 mg/L和5 mg/L有顯著性差異(P<0.01)；而按單個細胞MFA含量給藥干預后,各個相同MFA含量組α-SMA表達趨勢一致,且與MTT結果相符。在本實驗中,接種細胞數為10×104個按濃度給藥的實驗結果與兩種不同細胞數量情況下按單個細胞MFA含量給藥的實驗結果是一致的,預示在合適的細胞密度情況下按濃度給藥也會得到可靠的實驗結果,這就要求在接種細胞時要嚴格控制接種的細胞數量。

綜上所述,按單個細胞藥物含量給藥在MFA對HSC-LX2細胞體外藥效實驗中的應用更穩定、更實用、更科學,實驗重復性較好。

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Effect of two different dosage calculation methods on results of pharmacological experiment in vitro

Yang Chengfang, Li Li, Li Yongwen, Zhong Yujuan, Xiong Meili, Fang Shuping

(College of Pharmacy, Guilin Medical Institute, Guilin 541004, China)

Objective: To research the effect of two defferent dosage calculation methods (according to the concentration of drug and according to the drug content of single cell) on Methyl ferulic acid (MFA)which can inhibit the alpha SMA(α-SMA) expression in human hepatic stellate cells (HSC-LX2) stimulated by TGF-beta1 in vitro. Methods: HSC-LX2 cells were cultured in vitro, and the inhibition role of cells proliferation by MFA was tested by MTT method, thus determining MFA 1.25, 2.5 and 5 mg/L (the corresponding single cell MFA contents are 1.13×10-7,2.25×10-7and 4.5×10-7mg, respectively) 3 concentrations for subsequent experiments by MTT results. The quantity of two different cells was inoculated to the petri dish, then respectively by the concentration and the content of single cell above-mentioned for drug intervention for 72 hours, the mRNA expressions of α-SMA were assayed by RT-PCR and the protein content of α-SMA was mesured by Western blotting. Results: Under the condition of two kinds of different cells, according to calculation method of single cell drug content for drug intervention, the trend of the α-SMA mRNA and protein expression was consistent in the same content of MFA group, which was conformity with the results of MTT; but according to calculation method of concentration for drug intervention, the mRNA and protein expressions of α-SMA were quite different in the same MFA concentration group. Conclusion: The application effect of dosage calculation method according to the drug content of single cell in the pharmacological experiment of MFA acting on HSC-LX2 cells in Vitro is more stable and more scientific, and the experimental repeatability is good.

cytology experiment; dosage calculation method; pharmacological effect; methyl ferulic acid

DOI：10.16791/j.cnki.sjg.2016.01.010

2015- 06- 26修改日期:2015- 08- 17

國家自然科學基金資助項目(81360497)

楊成芳(1980—),女(壯族),廣西扶綏,醫學碩士,實驗師,主要從事肝纖維化、類風濕關節炎藥效學研究

E-mail:308823789@qq.com

李勇文(1969—),男,廣西柳州,教授,碩士生導師,研究方向為抗肝炎、纖維化藥物研究.

E-mail:liyongwen99@163.com

Q2-33

B

1002-4956(2016)1- 0035- 05