液相色譜-串聯質譜法測定葡萄干中赭曲霉毒素A含量

呂　斐，馬民安，王志宏，蘇遠科，羅　曉，胥　洪

（龍口出入境檢驗檢疫局，山東煙臺　265700）

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液相色譜-串聯質譜法測定葡萄干中赭曲霉毒素A含量

呂斐，馬民安，王志宏，蘇遠科，羅曉，胥洪

（龍口出入境檢驗檢疫局，山東煙臺265700）

建立葡萄干中赭曲霉毒素A（OTA）的液相色譜-串聯質譜測定方法。樣品經甲醇超聲提取，以乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動相，進行梯度洗脫，正離子多反應監測模式（MRM）測定。結果表明，赭曲霉毒素A在1～50 μg/L范圍內有良好的線性，相關系數R2＞0.999，方法回收率為79%～96%，相對標準偏差為3.1%～4.8%，定量限1.0 μg/kg。該方法前處理快速簡單，可用于對進出口葡萄干中赭曲霉毒素A的檢測。

葡萄干；赭曲霉毒素A；液相色譜-串聯質譜法

0　引言

赭曲霉毒素A（英文簡稱OTA）為真菌的次級代謝產物，可從谷類、干果制品、飼料、肉類及制品、奶制品、藥用植物、人血中檢出。試驗表明，OTA具有嚴重的腎毒性、肝毒性、神經毒性以及免疫毒性［1-4］。2008年，波蘭發出中國產葡萄干中OTA含量超標（20.7 μg/kg） 的預警通報，導致貨物扣留，造成較大經濟損失，給我國該食品行業出口造成不利影響。隨后，各國相繼對葡萄干中OTA規定了嚴格的限量要求，如歐盟科學委員會規定葡萄干中OTA的最高含量為10 μg/kg。

赭曲霉毒素A化學結構式見圖1。

目前，國內葡萄干中OTA的檢測標準有SN/T 1940—2007進出口食品中赭曲霉毒素A的測定方法，其采用免疫親和柱凈化、高效液相色譜法分析，基質干擾較大，且免疫親和柱價格昂貴、成本較高。

圖1　赭曲霉毒素A化學結構式

近年來，由于液相色譜-串聯質譜（LC-MSMS）技術具有靈敏度高、抗基質干擾能力強、定性準確等優點，在化學殘留物檢測方面的應用越來越廣泛。本文采用液相色譜-串聯質譜結合溶劑直接提取，建立了葡萄干中赭曲霉毒素A殘留量的測定方法。該方法操作簡便、成本較低，省略液液分配、免疫親和柱凈化等步驟，可以滿足殘留監控和風險評估的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1290型高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四級桿質譜儀（配有電噴霧離子源（Jet-ESI））、Masshunter色譜工作站；十萬分之一電子天平，瑞士Mettler Toledo公司產品；KQ3200型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；超純水機，美國Millipore公司產品。

赭曲霉毒素A標準品，購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，德國Merck公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1液質分析條件

（1）色譜條件。AgilentZORBAXEclipsePlusC18型色譜柱（2.1 mm×50 mm，3 μm）；柱溫35℃；流動相A為乙腈、B為0.1%甲酸水溶液；梯度程序為0～1 min 40%A，1～3 min從40%A線性增加至60% A，3～4 min 95%A，4～4.1 min由95%A降至40%A，4.1～5 min 40%A；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（Jet-ESI），正離子（ESI+）多反應檢測（MRM）模式，噴霧電壓4kV，干燥氣及霧化氣均為氮氣，干燥氣體溫度350℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力45 psi，裂解電壓100 V。

1.2.2標準溶液配制

準確稱取10 mg赭曲霉毒素A標準品，用甲醇溶解配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，在-18℃下冷凍避光保存，有效期3個月。

取1.0 mL的上述標準儲備液，用甲醇配成質量濃度為1.0 g/mL的標準工作液，待用，-4℃下避光保存，有效期1個月。

取適量的標準工作液，用空白葡萄干樣品基質配成質量濃度為1，2，5，10，50 μg/L的系列標準溶液，現用現配。

1.2.3樣品制備

取葡萄干（約500 g）用食品粉碎機粉碎后，制成試樣備用。稱取5.00 g樣品于50.0 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20.00 mL甲醇，超聲15 min。隨后在離心機中以轉速4 000 r/min離心5 min，吸取10.00 mL上清液至50 mL雞心瓶中，在35℃水浴旋蒸至干。加入乙腈和0.1%甲酸水溶液（配比為4∶6）2.00 mL溶解，渦旋，過0.2 μm微孔濾膜，待儀器測定。

2　結果與討論

2.1液相條件優化

2.1.1提取溶劑的選擇

赭曲霉毒素A是一種穩定的無色結晶化合物，呈弱酸性，易溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水，在甲醇中溶解后可在冰箱中保存1年。本試驗為了提高OTA的提取效率、減少干擾，分別考察了70%甲醇，80%甲醇，純甲醇作為提取溶劑。結果表明，采用純甲醇為提取溶劑時，測定的干擾最少，待測物的回收率最高，故最終選用純甲醇作為最終提取溶劑。

不同提取溶劑的回收率對比見表1。

表1　不同提取溶劑的回收率對比

2.1.2提取液優化與配比

將葡萄干空白樣品以及加標樣品對比，空白樣品中存在與OTA保留時間靠近的干擾峰，在加標后，干擾峰被OTA峰覆蓋，導致定量檢測不準確。為了提高OTA的分離效果，消除葡萄干基質的干擾，選擇用梯度洗脫程序進行優化。

葡萄干空白樣品色譜見圖2，葡萄干加標樣品色譜見圖3，色譜梯度條件見表2。

圖2　葡萄干空白樣品色譜

圖3　葡萄干加標樣品色譜

表2　色譜梯度條件

2.1.3流動相的選擇

甲酸流動相色譜見圖4，乙酸銨流動相色譜見圖5。

圖4　甲酸流動相色譜

圖5　乙酸銨流動相色譜

流動相的組成不僅影響目標化合物的色譜行為，而且還會影響其離子化效率。本方法采用乙腈和水作為流動相，但當流動相為乙腈-水時，出現了OTA峰拖尾的現象。所以，考慮添加甲酸或乙酸銨改善。結果發現，加入甲酸后能減少峰拖尾現象，并能提高目標分子的離子化效率，使質譜的靈敏度提高，響應值和峰形均優于乙酸銨，且甲酸的濃度在0.1%時，流動相pH值為3.5，OTA的保留時間差異和分離度較為滿意。試驗又比較了甲醇-水（含0.1%甲酸）和乙腈-水（含0.1%甲酸） 作為流動相，相較于甲醇-水（含0.1%甲酸）體系，OTA在乙腈-水（含0.1%甲酸）體系中峰寬更小、對稱性更好，出峰時間也靠前。因此，試驗采用乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動相。

2.2質譜條件優化

根據OTA分子的化學電離性質，選擇ESI+作為電離模式，干燥氣體溫度350℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速12 L/min，毛細管電壓4 000 V，碰撞氣高純氮（純度≥99.999%）。

采用針泵直接進樣方式確定赭曲霉毒素A的母離子，用于定性分析的離子對為m/z 404.2/358.2和m/z 404.2/239，其中定量分析離子為m/z 404.2/358.2。由于結構的不同，各自產生碎片離子所需要的碰撞能量都不同，在此條件下，能夠獲得較好的響應。

MRM分析的質譜參數見表3，赭曲霉毒素A的質譜見圖6。

表3　M R M分析的質譜參數

2.3標準曲線、線性范圍及定量限

用空白葡萄干樣品基質配制質量濃度為1，2，5，10，50 μg/L的標準工作液，按上述色譜條件進行分析，得出不同標準工作液質量濃度對應的峰面積，所得峰面積（Y）對質量濃度（X）做圖，計算回歸方程式和相關系數。

圖6　赭曲霉毒素A的質譜

質量濃度與峰面積值見表4，OTA標準曲線見圖7。

表4　質量濃度與峰面積值

圖7　O TA標準曲線

回歸方程為Y=1.084 8X+0.238 4，R2=0.999 7。回歸方程表明，赭曲霉毒素A在質量濃度為1～50 μg/L范圍內，峰面積與質量濃度成良好線性。

按照本方法測定，根據葡萄干樣品能可靠測得的最低質量濃度確定本方法對赭曲霉毒素A的定量限（LOQ，S/N=10）為1.0 μg/kg，這一數值低于國內、國外對葡萄干赭曲霉毒素A的限量標準。

2.4方法學考察

2.4.1回收率試驗

取適量赭曲霉毒素A標準溶液添加至空白葡萄干樣品中，使添加量相當于1，10，50 μg/kg，且每個水平各6份，進行樣品處理、上機，計算回收率。

方法回收率見表5。

由表5可知，回收率為79%～96%，本方法準確度良好。

2.4.2精密度試驗

方法精密度見表6。

每個加標水平平行測定6次，相對標準偏差為3.1%～4.8%，表明本方法精密度良好。

2.4.3實驗室間驗證

實驗室間赭曲霉毒素A驗證回收率見表7。

選擇系統內5家實驗室，在空白葡萄干樣品中添加3個水平的赭曲霉毒素A標準溶液，進行測定回收率，表明方法可靠。

表5 方法回收率

表6 方法精密度

表7　實驗室間赭曲霉毒素A驗證回收率

3　結論

相較于高效液相色譜結合免疫親和柱檢測方法，本試驗采用甲醇提取，省去了使用昂貴的免疫親和柱凈化的步驟，大大降低了試驗成本。直接提取上機也減少了前處理過程中OTA的損失，使得方法的回收率提高，3個水平的平均添加回收率在79%～96%，相對標準偏差為3.1%～4.8%，方法精密度良好，可作為進出口葡萄干中赭曲霉毒素A含量的準確定量方法，能滿足殘留監控和風險評估的要求。

［1］郝俊冉，許文濤，黃昆侖.赭曲霉毒素A生成轉化及致毒機制的研究進展 ［J］.食品工業科技，2012（12）：427-433.

［2］張愛華，馮璐璐，馬彥娜，等.赭曲霉毒素A分析方法研究進展 ［J］.中國公共衛生，2012（7）：1 003-1 008.

［3］賈欣，徐詩涵，梁志宏，等.赭曲霉毒素A的微生物脫毒研究進展 ［J］.生物技術通報，2014（12）：18-23.

［4］夏凱，賀曉云，郝俊冉，等.基于核磁共振掃描（NMR）的赭曲霉毒素A毒性血漿代謝組學研究 ［J］.農業生物技術學報，2013（12）：1 426-1 433.◇

Determination of Ochratoxin A in Raisin by LC-MS-MS

LV Fei，MA Min'an，WANG Zhihong，SU Yuanke，LUO Xiao，XU Hong
（Longkou Entry Exit Inspection and Quarantine Bereau，Yantai，Shandong 265700，China）

A confirmative method is developed for determining ochratoxin A（OTA）in raisin by liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry.The sample is treated by ultrasonic extraction with methol.Mobile phase is a blend solution consists of acetonitrile and water（0.1%formic acid） .The separation is carried out with gradient elution.The deteIction is achieved in the positive chemical ionization and multi-reaction monitoring（MRM）mode.Results show that with the optimized condition，a good linearity（R2＞0.999）is achieved for the target compounds in the range of 1～50 μg/L.The overall recoveries ranged from 79%～96%，and the relative standard deviations（RSD）are between 3.1%and 4.8%，the limits of quantification of OTA analytes are 1.0 μg/kg.The results show that the method is simple，accurate and suitable for the determination of OTA in raisin.

raisin；ochratoxin A；liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS-MS）

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.015

1671-9646（2016）07a-0051-04

2016-04-28

呂斐（1982— ），女，本科，工程師，研究方向為食品檢測。