復合益生菌對昆明小鼠生長性能和腸道酶活性的影響

葉紅玲， 劉 冬， 葉 明， 黃守敏

(1.安慶職業技術學院園林園藝系，安徽安慶 246003；2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

?

復合益生菌對昆明小鼠生長性能和腸道酶活性的影響

葉紅玲1， 劉 冬1， 葉 明2， 黃守敏1

(1.安慶職業技術學院園林園藝系，安徽安慶 246003；2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

[目的]探討飼料中添加復合益生菌對斷奶小鼠的安全性及其腸道酶活性的影響。[方法]以蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5制備復合益生菌劑。以復合益生菌飼喂昆明小鼠，評價其安全性，并分析其對斷奶昆明小鼠生長性能、腸道纖維素酶活和蛋白酶活力的影響。[結果]此3株菌株制備的復合益生菌安全的較好，能顯著提高昆明小鼠日增重。試驗組的小鼠在飼喂含有復合益生菌制劑的添加劑后，其腸道內的蛋白酶活和纖維素酶活都明顯高于對照組。[結論]復合益生菌能夠顯著提高昆明小鼠的生長性能和腸道內酶活力。

復合益生菌；生長性能；蛋白酶；纖維素酶

Fuller[1]將益生菌定義為“活著的、對宿主有益的、能夠維持腸內微生態平衡的微生物飼料添加劑”。Havenaar等[2]于1994年對益生菌的定義進行了修訂：益生菌是含活菌和死菌，包括其組分和產物的微生物制品，經口腔或其他黏膜途徑攝入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機制。目前益生菌是泛指對人和動物機體有益的微生物，是一種通過改善腸道菌群平衡而對動物產生有益作用的活微生物飼料添加劑，包括乳酸菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、酵母菌等多種復合或單一培養物。

益生菌因其安全、高效、不產生耐藥性等特點而具有巨大的潛能。益生菌主要通過以下途徑在動物和人機體內發揮其作用：①補充有益菌群，維持消化道菌群平衡，預防和治療菌群失調[3]；②直接產生氨基酸、維生素等營養物質，補充機體營養成分，促進畜禽生長[4]；③協助機體消除毒素和有害代謝產物[5]；④提高機體免疫力；⑤產生多種有助于消化吸收的酶類(如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等)，從而增加宿主總酶活性。將益生菌作為飼料添加劑，可以提高飼料利用率，降低成本，在促進動物生長、減少糞便排放、改善生態環境和動物疾病防治等方面效果明顯，在飼料領域受到極大關注[6]。此外，抗生素在飼料中的濫用會通過食物鏈傳遞間接被人體吸收，抗生素的毒性反應對腎臟和肝臟等臟器有損害，同時還會造成耐藥菌株不斷產生[7]。有研究人員以蠟樣芽孢桿菌作為益生菌替代飼料，飼喂斷奶仔豬能夠提高其體重，促進飼料轉化率，降低斷奶仔豬的腹瀉率和死亡率，因此已被廣泛用作畜牧場的飼料添加劑[8]。乳酸桿菌在國際上被廣泛應用于發酵食品及飼料中，沒有明顯的副作用。此外，乳酸桿菌的毒性也可能依附在芽孢桿菌和乳酸桿菌這些菌株中。因此，在畜禽生產中添加益生菌作為飼料添加劑前，使用實驗動物研究菌株的安全性是很有必要的[9]。隨著人民生活水平和消費水平的提高，對農產品國際市場競爭力壓力的增加以及對濫用抗生素危害認識的深入，益生菌制劑受到越來越多的關注，其在飼料和功能食品領域必將具有十分廣闊的發展空間[10]。筆者使用蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5益生菌進行動物試驗，評價其安全性，分析其對昆明小鼠生長性能、腸道纖維素酶活性和蛋白酶活性的影響。

1　材料與方法

1.1菌株和培養基纖維素酶產生菌B1-1和蛋白酶產生菌JC128 使用LB液體培養基培養，乳酸桿菌SL1-5 在MRS液體培養基上，37 ℃下培養24 h后達到穩定期。制備含有蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5的培養物，且近似濃度達到1×108CFU/mL或1×109CFU/mL。使用LB和MRS培養基檢測活菌數。

1.2試驗動物及其飼養管理40只健康的斷奶昆明小鼠，雌雄各半，體重為13～15 g(平均體重為14 g)，分成4籠，每籠10只小鼠。使用標準的實驗室飼料飼喂小鼠，自由飲水。在試驗期間維持光照和黑暗按照常態旋回，控制溫度在(22±2)℃，濕度(55±2)%。

1.3試驗設計在試驗條件下馴化小鼠24 h。每天補充飲用水，并更換飼料。毒物學研究持續10 d，而促生長試驗持續14 d。盡管每天記錄每只小鼠的體重，在試驗末期也要留心觀察小鼠毛發的光澤。在試驗結束前，所有的小鼠都使用頸部脫臼致死。

1.4亞急性毒性試驗將40只小鼠隨意分成4組，每組10只小鼠，并在試驗開始前對每只小鼠進行稱重。試驗組Ⅰ小鼠飲用無菌蒸餾水，試驗組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的小鼠分別飲用濃度1×108CFU/mL 或1×109CFU/mL的菌株B1-1、JC128和SL1-5的菌懸液，通過針管(長5 cm，直徑3 mm)灌胃，每天3次，持續10 d ( 3×108CFU/d或3×109CFU/d) 。每天記錄試驗小鼠的生長和死亡情況，觀察每只小鼠臟器的肉眼病理學特征。取小鼠的脾和肝，并精確稱重。

1.5復合益生菌制劑蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128在LB培養基上培養，乳酸桿菌SL1-5在MRS培養基中生長，37 ℃下培養24 h，以獲得穩定期。離心分離后獲得菌株，使用無菌水洗滌2次，懸浮1次。乳酸桿菌SL1-5的接種物濃度約1×108CFU/mL或1×109CFU/mL。

通過口腔灌胃的方法，每天給小鼠飼喂濃度為1×108CFU/mL或1×109CFU/mL復合益生菌制劑，持續14 d。試驗動物飼喂標準的實驗室飼料，自由飲水。對照組動物飲用無菌的蒸餾水。

1.6生長性能評價每天使用電子天平(Sartorius BP2100)稱量試驗動物的體重。增重為每只小鼠的最終體重減去最初體重的平均值。比生長速率(SGR)反映小鼠的生長速率。每天每籠飼料攝取(FI)及水攝取可以表示為每個動物在整個時期分配飼料或水消耗除去動物的數目。消耗指數等于FI與WG的比值。

1.7腸道酶活力的測定剝離出各個片段粗糙的腸混合物于4 ℃下保存。分離腸的樣品用冷蒸餾水漂洗。蛋白酶活力的測定參照Lowry等[11]的方法，采用福林-酚法；纖維素酶活力的測定依據Lungisa等[12]和Zhou等[13]的方法。

1.8數據統計與分析使用SPSS 16.0統計軟件對試驗數據進行Duncan’s多重比較和ANOVA方差分析。P<0.05表示差異顯著。

2　結果與分析

2.1亞急性毒性試驗整個試驗期間，試驗動物沒有腹瀉、疾病或死亡。在試驗期末，所有飼喂細菌的小鼠都活著且是健康的。然而，處理組和對照組試驗動物的毛發光澤沒有明顯的差異。處理組小鼠毛發光滑且潔白。從圖1可以看出，飼喂不同細菌和水對小鼠的肝重/體重、脾重/體重、脾重/肝重沒有顯著影響(P>0.05)。

圖1　益生菌對小鼠的肝重/體重、脾重/體重和脾重/肝重的影響Fig. 1　Effects of compound probiotics on the liver weight/body weight, spleen weight/body weight and spleen weight/liver weight of mice

2.2生長性能從圖2可以看出，飼喂復合益生菌制劑的小鼠體增重比對照組明顯增加。考慮到試驗結果，在后來的試驗中選擇大麥飼料和清潔的復合益生菌。

圖2　復合益生菌制劑對小鼠體增重的影響Fig. 2　Effects of by adding compound probiotics on the weight gain of mice

使用最佳劑量(108CFU復合益生菌制劑)來研究小鼠的生長性能。從圖3可以看出，飼喂復合益生菌劑的小鼠體增重較僅攝取水有較大提高。試驗期內，處理組飼喂復合益生菌制劑的小鼠體增重較對照組提高了28%。未經處理小鼠的消耗指數達到2.64，而飼喂復合益生菌制劑處理組小鼠的消耗指數達到1.2。由此可見，飼喂復合益生菌制劑和水的小鼠體增重沒有顯著差異。飼喂復合益生菌制劑和水的小鼠的消耗指數也沒有顯著差異。

圖3　復合益生菌制劑對小鼠生長性能的影響Fig. 3　Effects of compound probiotics preparations on growth performance of mice

2.3腸道酶活性由表1可知，B1-1菌株對小鼠腸道內的纖維素酶活有一定的促進效果，JC128菌株對蛋白酶活有一定的促進效果。B1-1和JC128菌株混合飼喂，纖維素酶活和蛋白酶活的升高幅度最大，與對照組相比小鼠CMC酶、FPA酶和蛋白酶活性分別升高了48.70%、30.15%和30.23%。此外，B1-1菌株還具有蛋白酶活性，JC128菌株具有纖維素酶活性，且并非單純的加減作用。究其原因，可能是因為2種菌存在協同效應，B1-1菌株豐富的代謝產物刺激JC128菌株生長，JC128菌株生長耗氧創造適宜B1-1菌株生長的厭氧環境，從而2菌種均大量生長，酶活較高。

表1　芽孢桿菌對小鼠腸道酶活性的影響±SD,n=10)

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。

Note: * indicated significant differences compared with the control (P<0.05); and ** indicated extremely significant differences compared with the control (P<0.01).

3　結論

由蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5制備的復合益生菌安全性較好，且對小鼠的生長性能有促進作用。該研究結果表明飼喂108CFU益生菌細胞可以顯著提高小鼠的體重。此外，復合益生菌制劑能夠顯著提高小鼠的消化能力、飼料利用率和腸道內酶活力。

[1] FULLER R.Probiotic in man and animals [J].The Journal of applied bacteriology,1989,66：365-378.

[2] HAVENAAR R,SPANHAAK S.Probiotics from an immunological point of view[J].Current opinion in biotechnology,1994,5(3)：320-325.

[3] HAMILTON-MILLER J M T.The role of probiotics in the treatment and prevention ofHelicobacterpyloriinfection[J].International journal of antimicrobial agents,2003,22 (4)：360-366.

[4] STANTON C,ROSS P R,FITZGERALD F G,et al.Fermented functional foods based on probiotics and their biogenic metabolites[J].Current opinion in biotechnology,2005,16(2)：198-203.

[6] FREIRE J P B,DIAS R I M,CUNHA L F,et al.The effect of genotype and dietary fibre level on thecaecal bacterial enzymeactivity of young piglets:Digestive consequences[J].Animal feed science and technology,2003,106:119-130.

[7] 曾化松,王艷琳.抗生素濫用的現狀及應對策略[J].中國衛生事業管理,2012(5):341-343.

[8] ALEXOPOULOS C,KARAGIANNIDIS A,KRITAS S K,et al.Field evaluation of a bioregulator containing liveBacilluscereusspores on health status and performance of sows and their litters[J].Journal of veterinary medicine series A,2001,48:137-145.

[9] GOLDIN B R.Health benefits of probiotics [J].British journal of nutrition,1998,80:203-207.

[10] DONOHUE D C,SALMINEN S,MARTEAU P.Safety of probioticbacteria[M]//SALMINEN S,VON WRIGHT A.Lactic acid bacteria.2nd ed.New York:Marcel Dekker,998:369- 383.

[11] LOWRY O H,ROSEBROUGH N J,FARR A L.Protein measurement with the Folin-phenol reagent[J].The journal biological chemistry,1951,193:265-275.

[12] LUNGISA M,BRENDAN S W,BRETT I P.Cellulases (CMCases) and polyphenol oxidases from thermophilicBacillusspp.isolated from compost[J].Soil biology & biochemistry,2006,38:2963-2966.

[13] ZHOU J,WANG Y H,CHU J,et al.Identification and purification of the main components of cellulases from a mutant strain ofTrichodermavirideT 100-14[J].Bioresource technology,2008,99：6826-6833.

Effects of Compound Probiotics on Growth Performance and Intestinal Protease Activity in Konmin Mice

YE Hong-ling1,LIU Dong1，YE Ming2et al

(1. Department of Garden and Horticulture, Anqing Vocational and Technical College, Anqing, Anhui 246003; 2. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology,Hefei,Anhui 230009)

[Objective] To research the effects of adding compound probiotics in feed on the growth performance and intestinal protease activity in post-weaning Konmin mice. [Method] Three probiotic strains (BacilluscereusB1-1,BacilluscereusJC10-8 andLactobacillusSL1-5) were prepared for compound probiotics. Konmin mice were fed by the compound probiotics so as to evaluate its safety. Effects of compound probiotics on the growth performance,protease activity and cellulase activity of post-weaning Konmin mice were researched. [Result] These strains were secure,and significantly increased the daily body weight gain of Konmin mice. After adding compound probiotics in mice feed in test group,the protease activity and cellulase activity were significantly higher than those in control group. [Conclusion] Compound probiotics greatly enhances the growth performances and intestinal enzyme activities in Konmin mice.

Compound probiotics; Growth performance; Protease; Cellulase

安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A148)；安徽省重大教學改革研究項目(2015zdjy181)。

葉紅玲(1981- )，女，安徽安慶人，工程師，碩士，從事農業微生物研究。

2016-05-25

S 865.1

A

0517-6611(2016)19-173-03