微生物抗藥性進化的分子生物學證據(jù)及進化樹構(gòu)建方法

馬亢，劉海濱

（商丘師范學院生命科學學院，河南商丘476000）

微生物抗藥性進化的分子生物學證據(jù)及進化樹構(gòu)建方法

馬亢，劉海濱

（商丘師范學院生命科學學院，河南商丘476000）

摘要：微生物的抗藥性一直是困擾人類的重大問題，尤其是最近超級細菌的出現(xiàn)更是為人類敲響了警鐘——對微生物的抗藥性研究已經(jīng)刻不容緩。本論述梳理了近年來微生物進化方面的分子生物學證據(jù)，并介紹了兩種最常用建立進化樹的生物信息學方法，從而更加直觀地找出他們的進化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：微生物；抗藥性；進化；進化樹

DOI10.3969/j.issn.1672-6375.2016.03.024

我們通過對微生物抗藥性進化的研究來減緩其進化速度和找到其進化的規(guī)律性，以便更好地篩選相關(guān)藥物，為人們的生活和生產(chǎn)活動服務(wù)。近年來，分子生物學迅速發(fā)展，使我們在分子水平能夠找到微生物進化的過程以及他們之間的進化關(guān)系，借助一些生物學專業(yè)軟件我們可以繪制出進化樹，從而更加直觀的找出他們的進化關(guān)系。找出微生物抗藥性的進化規(guī)律是防止微生物進一步在抗藥性上進化的有利武器。

1　微生物抗藥性進化的分子生物學證據(jù)

1.116S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

16S rRNA是原核核糖體30S小亞基的組成部分，存在于所有細菌的基因組中［1］。其可以作為測量各類生物進化的工具的原因有以下幾點：（1）rRNA是生物存活不可缺少的，普遍存在于真核和原核生物中，在生物進化歷程中其穩(wěn)定性比較高；（2）在16S rRNA分子中，有穩(wěn)定度不同的序列區(qū)域，適用于測量進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系；（3）相對分子質(zhì)量適宜序列分析。

1.2微生物抗藥性的分子機制

1.2.1鈣調(diào)磷酸酶機制

鈣調(diào)磷酸酶是真核細胞信號傳導途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對于菌株應(yīng)對環(huán)境壓力（抗生素作用）是必不可少的。細胞內(nèi)有一種幫助其他蛋白質(zhì)折疊并運送它們到達細胞內(nèi)適當?shù)奈恢玫姆肿印肿影閭H熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）。鈣調(diào)磷酸酶發(fā)揮正常功能必須借助HSP90對其亞基進行正確折疊。HSP90的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)變異將導致細菌出現(xiàn)抗藥性［2］。PKA可以將轉(zhuǎn)錄因子CRZ1磷酸化，使其無法進入細胞核，造成轉(zhuǎn)錄異常。同時PKA出現(xiàn)異常，使相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄受阻形成抗藥性［3］。

1.2.2轉(zhuǎn)運蛋白機制

一些抗生素進入細菌體內(nèi)必須借助轉(zhuǎn)運蛋白的運輸，才能發(fā)揮殺菌作用。一些運輸?shù)鞍祝ㄈ鏏BC運輸?shù)鞍祝┛梢詫⑺巹哪?nèi)層轉(zhuǎn)移至外層而排出細胞體外；另外一些運輸?shù)鞍祝ㄈ鏑YP51蛋白）基因與藥物作用時易發(fā)生點突變，造成編碼蛋白與藥物親和力下降，使抗生素作用效果大大降低，導致抗藥性。

1.2.3rpsL基因機制

鏈霉素作用于核糖體30S小亞基，直接抑制蛋白質(zhì)的合成。其直接的位點為核糖體上的S12和16S RNA結(jié)構(gòu)域，染色體上編碼核糖體蛋白S12的高度保守的rpsL基因的單堿基突變，干擾了蛋白的生物合成，從而使病原細菌具有高水平抗性且能穩(wěn)定遺傳。一些研究對rpsL和16S rRNA基因序列進行分析和正反互補驗證檢測，證明了rpsL基因的第43位堿基突變造成抗藥性突變［4］。

抗性基因常與質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子關(guān)聯(lián)，鏈霉素的大量使用在一定程度上加劇了選擇的進程，且自然界中本身存在的鏈霉素抗性基因庫，二者的共同作用造成了抗性基因的大量傳播。

基因重組是人類進化的一種可能的方式，微生物能大量進行基因重組，原核生物和真核生物中普遍存在的轉(zhuǎn)座作用是微生物發(fā)生抗藥性進化的一種重要機制［5］。

2　微生物進化樹的構(gòu)建

分析一個完整的進化樹需要以下幾個步驟：（1）對目的多序列目標進行排列；（2）構(gòu)建一個進化樹；（3）對進化樹可信度進行評估。

在系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建中應(yīng)用最為廣泛的是PHYLIP和MEGA兩款生物軟件，通過這兩種軟件的使用，我們可以得到較為清楚的生物進化關(guān)系。

2.1利用PHYLIP3.65軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹［6］

具體過程見圖1所示：

圖1　PHYLIP3.65軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹過程圖

2.2利用MEGA3.1軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹［7］

具體過程見圖2所示：

圖2　MEGA3.1軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹過程圖

構(gòu)建樹的過程所耗時間和序列的數(shù)量和長短成正比。樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗證中該樹枝可信度的百分比。

3　結(jié)束語

伴隨著抗生素的大規(guī)模不當使用，微生物的抗藥性逐年增加，這給人們的健康成本帶來了極大的挑戰(zhàn)。人們不斷地篩選新的抗菌藥物，但要從根本上解決抗藥性的問題，我們必須了解微生物在抗藥性方面的進化規(guī)律。微生物的抗藥性和人類的抗生素篩選行為，可以看成是微生物為了適應(yīng)人類制造的逆境（抗生素）而通過進化、突變等多種方式適應(yīng)生存的結(jié)果，因此理順微生物的進化模式，能夠幫助我們找到更好的抗生素篩選策略，并能夠從根本上研究解決微生物進化過快的問題。我們可以用分子生物學、基因組學、生物信息學的方法來研究其進化過程，找出規(guī)律，從而為進一步篩選藥物以及合理使用藥物提供科學依據(jù)。

參考文獻：

［1］劉琳，劉洋，劉紅娟.基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析在微生物進化關(guān)系中的應(yīng)用［J］.生物學通報，2008，43（11）.

［2］Seung Oe Lim，Sung Gyoo Park.Expression of heat shock proteins（HSP27，HSP60，HSP70，HSP90，GRP78，GRP94）in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules［J］.World Journal of Castroenerol 2002；11 （14）：2072-2079.

［3］馬寧，崔志峰.致病真菌抗藥性機制的研究進展［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2010，24（5）.

［4］葉滔，馬志強.植物病原真菌對甾醇生物合成抑制劑類（SBIs）殺菌劑的抗藥性研究進展［J］.農(nóng)藥學學報，2012，14 （1）：1－16.

［5］Chiou CS，Jones AL.Molecular analysis of high-level streptomycin resistance in Erwinia amylovora［J］.Phytopathology，1995，85：324-328.

［6］張光明，吳廷瑞.微生物與人類進化［J］.醫(yī)學與哲學，1999，20（7）：20-22.

［7］陶士珩.生物信息學（普通高等教育十一五規(guī)劃教材）［M］.北京：科學出版社，2007.

中圖分類號：Q939

文獻標識碼：A

收稿日期：2015-11-18

作者簡介：馬亢（1983-），男，回族，實驗師，碩士，主要研究方向：生物化學與分子生物學。