UPLC-MS/MS法測定中藥材中齊墩果酸與熊果酸的含量

楊曉靜，陳麗娜，秦　瑤，李賽男，唐　英，李森林，劉春明

(長春師范大學　中心實驗室，吉林　長春　130032)

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UPLC-MS/MS法測定中藥材中齊墩果酸與熊果酸的含量

楊曉靜，陳麗娜，秦瑤，李賽男，唐英，李森林，劉春明*

(長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032)

建立了一種同時檢測中藥材中齊墩果酸(OA)和熊果酸(UA)含量的超高效液相色譜串聯質譜方法。采用超高效液相色譜-三級四極桿質譜(UPLC-TQMS)法對樣品進行測定，Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)進行分離，以乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(氨水調至pH 9.24)為流動相，梯度洗脫；負離子模式下檢測。結果表明，齊墩果酸和熊果酸在0.5～50.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)分別為0.999 8和0.999 7；檢出限(S/N=3)分別為0.006 6,0.012 8 ng/mL，定量下限(S/N=10)分別為0.002 0，0.003 8 ng/mL；對OA和UA進行加標回收實驗，平均回收率分別為101.1%和100.8%，相對標準偏差(RSD，n=9)分別為1.8%和0.04%。對10種不同中藥材中齊墩果酸和熊果酸含量進行檢測，結果表明該方法快速簡便、準確度高、重現性好，可用于含有齊墩果酸和熊果酸的中藥材含量測定。

中藥材；齊墩果酸；熊果酸；超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)

齊墩果酸(OA)和熊果酸(UA)是互為同分異構體的2種五環三萜類化合物[1]，在自然界中分布十分廣泛且具有很多的生物活性和藥理活性，其結構式見圖1。其中齊墩果酸分子式為C30H48O3，屬于β-香樹脂醇型五環三萜類化合物[2]，多以游離形式或與糖結合的形式存在于約60個科190種植物中[2]，具有保肝、消炎、降糖、抗HIV和抗腫瘤[3]等藥理作用。熊果酸為α-香樹脂醇型五環三萜類化合物，以游離形式或與糖結合的形式存在于約7個科62種植物中[3]，具有抑制血管生成、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗HIV[4]等藥理作用。目前已報道的齊墩果酸和熊果酸的檢測方法有高效液相色譜-蒸發光檢測器(HPLC-ELSD)法[5]、反相高效液相色譜-紫外檢測器(RP-HPLC-DAD)法[6]、反相高效液相色譜-蒸發光檢測器(RP-HPLC-ELSD)法[7]、薄層掃描(TLCS)法[8]、氣相色譜(GC)法[9]、超高效液相色譜法(UPLC)[10]以及高效液相色譜法(HPLC)[11]等。但由于齊墩果酸和熊果酸的結構性質極其相似，以上方法存在靈敏度低、干擾大、分析時間長等不足。本研究建立了超高效液相色譜-三級四極桿質譜測定中藥材中的齊墩果酸和熊果酸含量的方法，并對木瓜[12]、夏枯草[13]、山茱萸[14]、連翹[15]、山楂[16]、女貞子[17]、烏梅[18]、石榴皮[19]、柿蒂[20]以及白花蛇舌草[21]10種常用中藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量進行測定。結果表明，該方法與已報道方法相比具有有機溶劑用量少、干擾小、分析速度快、準確度高且超高效分離的特點，此外，該方法的定量下限可達ng級，靈敏度明顯高于其他方法，為中藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量檢測提供了科學依據。

1　 實驗部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜-三級四極桿質譜儀(Acquity UPLC-Xevo TQ-S,Waters公司,美國)：I class二元高壓泵、FTN自動進樣器、TQ-S質譜、Masslynx V4.1工作站；0.1 mg電子天平(BSA124S，賽多利斯，德國)；超聲清洗儀(KQ-500E型，習仁科學儀器有限公司，上海)；具塞試管10 mL；濾膜(0.22 μm)。

齊墩果酸標準品(純度≥98.5%，CAS：508-02-1)、熊果酸標準品(純度≥98.5%，CAS：77-52-1)；甲酸(色譜純)、乙酸銨(色譜純≥99.0%，CAS：631-61-8)購自Aladin公司；氨水(可用于LC-MS濃度≥25%，Aladin公司，CAS：1336-21-6)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；實驗用水為超純水(Microcon YM-100，美國Millipore公司)；10種中藥材樣品購自吉林省長春市同仁堂，由長春師范大學中心實驗室陳麗娜老師鑒定。

1.2對照品溶液的制備

分別精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品1.00 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，于4 ℃下保存，使用前稀釋至所需濃度。

1.3供試品溶液的制備

分別精密稱取10種中藥材樣品細粉0.20 mg于具塞試管中，精密加甲醇5 mL,密塞，稱定質量，在室溫下浸漬2 h，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻后過濾，取濾液于4 ℃下保存，使用前稀釋至所需濃度，過0.22 μm濾膜備用。

1.4色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱：Weters AcquityTMBEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱溫：30 ℃；進樣體積5.00 μL；流動相：乙腈(A)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(B)(氨水調至pH 9.24)；梯度洗脫程序：0～0.5 min，67%A，0.5～3.0 min，67%～70%A，3.0～3.5 min，70%～95%A，3.5～5.0 min，95%～67%A；流速：0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)。采用負離子模式；毛細管電壓：2.87 kV；離子源溫度：120 ℃；去溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔氣流量：150 L/h；去溶劑氣流量：697 L/h；碰撞氣為氬氣，流速為0.15 mL/min；檢測模式：多反應監測模式(MRM)；兩種化合物的離子對見表1。

表1　齊墩果酸和熊果酸的質譜參數條件

2　結果與討論

2.1質譜條件的選擇

采用初始流動相稀釋齊墩果酸和熊果酸標準品，分別對兩個標準品溶液進行全掃描，確定每種化合物的母離子，然后對其進行子離子掃描，選出豐度較高的子離子作為定量離子，建立多離子反應監測(MRM)離子對。然后結合流動相對其他質譜參數(如干燥氣流速、錐孔氣流速、毛細管電壓、干燥氣溫度等)進行優化，確保靈敏度達到最佳值。優化的質譜參數如“1.4”所示。

2.2色譜條件的優化

在離子對色譜中，組分離子與平衡離子的生成以及離子對的形成均與流動相的pH值密切相關。從上述流動相體系的考察可看出，相對于酸性環境，堿性環境更有利于二者的分離，因此實驗用氨水調節流動相中水相的pH值(分別為4.01，7.24，8.39，8.90，9.24)并記錄其分離情況。結果表明，隨著pH值的增加，二者的分離情況得到改善，在pH 9.24時，齊墩果酸和熊果酸可在5 min內達到良好分離。

此外，流動相的流速對分離效果也有影響，低流速相對高流速更有助于分離，但會延長分離時間。分別對流速為0.2 mL/min和0.3 mL/min時的分離情況進行考察，結果顯示，流速為0.2 mL/min時的出峰時間略晚于流速為0.3 mL/min，但分離度無明顯差異，故選擇流速為0.3 mL/min。

2.3方法驗證

2.3.1線性關系分別取對照品儲備液，精確稀釋成濃度分別為0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 ng/mL的混合對照品溶液，在優化條件下分別進樣測定，重復3次，以各物質特征碎片離子峰面積的平均值(Y)對被測物質的質量濃度(X，ng/mL)進行線性回歸，得到回歸方程、相關系數和線性范圍。結果顯示，OA和UA在0.5～50.0 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數分別為0.999 8,0.999 7，方法檢出限(S/N=3)分別為0.006 6，0.012 8 ng/mL，定量下限(S/N=10)分別為0.002 0，0.003 8 ng/mL。方法具有較高的靈敏度，當樣品中目標物濃度超過此線性范圍時，可適當稀釋后進行測定。

2.3.2精密度以白花蛇舌草樣品作為供試品，采用本方法在1 d內選取6個不同的時間對同一供試樣品中齊墩果酸和熊果酸含量進行檢測，連續測定3 d，根據峰面積的變化值求出齊墩果酸和熊果酸的相對標準偏差(RSD)分別為1.8%和1.7%。

2.3.3重復性以白花蛇舌草樣品作為供試品，取同一批次的6個獨立樣品，采用本方法進行檢測，根據所得峰面積求出齊墩果酸和熊果酸對應的RSD均為1.4%。

2.3.4穩定性以白花蛇舌草樣品作為供試品，取同一批供試品，采用本方法分別在0，2，4，8，10，12 h進行檢測，根據所得峰面積求出齊墩果酸和熊果酸對應的RSD分別為1.0%和1.8%。

2.3.5回收率以白花蛇舌草樣品作為供試品，精密稱取9份白花蛇舌草粉末，每份約1.0 g，每3份為一組，每組分別精密加入一定量的齊墩果酸和熊果酸對照品。按“1.3”方法制備供試品溶液，采用本方法檢測，根據峰面積計算齊墩果酸和熊果酸的回收率及RSD，結果見表2。齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為101.1%和100.8%，RSD(n=9)值分別為1.8%和0.04%，說明該方法的準確度和精密度均較高。

表2　回收率試驗

2.4樣品測試

取10種常見的中藥材，在優化條件下進行檢測，結果見表3。由表3可見，本研究的10種同批中藥材中，木瓜中齊墩果酸和熊果酸的總含量最高，可達31.26 mg/g，烏梅中齊墩果酸和熊果酸的總含量相對較少，僅1.72 mg/g。該方法可快速準確地測定出中藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量。

表310種中藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量(n=2)

Table 3Contents of OA and UA in 10 kinds of Chinese herbal medicine(n=2)w/(mg·g-1)

3　結　論

本文首次建立了UPLC-MS/MS同時檢測中藥材中的齊墩果酸和熊果酸含量的方法，采用Weters AcquityTM BEH C18色譜柱分離，以乙腈-水(含5 mmol/L乙酸銨，氨水調至pH 9.24)為流動相進行梯度洗脫，二者可在短時間內達到良好的分離。應用本法對10種常用中藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量進行檢測，結果表明，該方法重現性好、操作簡便、靈敏度和準確度高，可用于傳統中藥材中兩者的含量測定。

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Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Chinese Herbal Medicine by UPLC-MS/MS

YANG Xiao-jing,CHEN Li-na,QIN Yao,LI Sai-nan,TANG Ying,LI Sen-lin,LIU Chun-ming*

(Central Laboratory,Changchun Normal University,Changchun130032,China)

An ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of oleanolic acid(OA) and ursolic acid(UA) in Chinese herbal medicine.The sample was detected by ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The separation of two compounds was achieved on a Waters Acquity UPLC BEH C18column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm) with a mobile phase of 5 mmol/L ammonium acetate in water(ammonium hydroxide adjust pH 9.24) and acetonitrile in gradient elution mode.The detection of the compounds was performed in negative ion mode.The result indicated that the concentration of OA and UA had good linear relationships with peak area in the concentration range of 0.5-50.0 ng/mL,and the correlation coefficients(r2) were 0.999 8 and 0.999 7,respectively.LODs(S/N=3) of the two compounds were 0.006 6 ng/mL and 0.012 8 ng/mL,respectively.LOQs(S/N=10) were 0.002 0 ng/mL and 0.003 8 ng/mL,respectively.The recoveries of OA and UA were 101.1% and 100.8%,with RSDs(n=9) of 1.8% and 0.04%,respectively.The method showed the advantages of simpleness,high accuracy and good reproducibility,and could be used for the detection of OA and UA content in the Chinese herb.

Chinese herb；oleanolic acid；ursolic acid;ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

2015-11-25；

2016-03-10

國家自然科學基金資助項目(31170326,31370374)；吉林省科技廳資助項目(20130413043 GH)

劉春明，博士，教授，研究方向：天然藥物分析，Tel：0431-86168777，E-mail:ccsf777@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.022

O657.65；TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0753-05

實驗技術