超高效液相色譜-串聯質譜法測定草莓中19種農藥殘留量

馬　琳，黃蘭淇，陳建波，尹　君，占繡萍，趙　莉*

(1.上海市農業技術推廣服務中心，農業部農藥質量監督檢驗測試中心(上海)，上海　201103；2.上海市浦東新區農產品安全中心，上海　2012021)

?

超高效液相色譜-串聯質譜法測定草莓中19種農藥殘留量

馬琳1，黃蘭淇1，陳建波1，尹君2，占繡萍1，趙莉1*

(1.上海市農業技術推廣服務中心，農業部農藥質量監督檢驗測試中心(上海)，上海201103；2.上海市浦東新區農產品安全中心，上海2012021)

建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)同時測定草莓中19種農藥的快速、靈敏分析方法，并將此方法應用于草莓中農藥殘留水平的評估。草莓樣品經乙腈勻漿提取，NH2固相萃取柱凈化,以反相C18色譜柱分離，0.1%甲酸-水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，多反應監測模式進行定量分析。運用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜儀(UPLC-Q-TOF)考察了不同前處理方法的凈化效果，研究了草莓樣品的基質效應，并以空白草莓樣品添加標準溶液的方法確定定量下限。結果表明：19種農藥在0.000 5～1.0 mg/L范圍內均呈良好的線性關系，相關系數大于0.999；在高、中、低3個加標水平下的平均回收率為77.3% ～100.3%，相對標準偏差(n=5)不大于12.3 %；雙炔酰菌胺、聯苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的定量下限為0.001 mg/kg，其余均為0.01 mg/kg。該方法簡單、快速、靈敏度高，具有良好的抗基質干擾能力，可滿足草莓中19種農藥殘留檢測的要求。

超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；農藥；殘留；草莓

設施草莓(Fragaria ananassa Duchesne)具有栽培容易、管理方便、生產成本低、產量高、收益好等優點，近年來成為各地種植業結構調整的主要內容和農民增收的主要途徑。草莓以其柔軟多汁、酸甜適度、芳香濃郁、營養豐富等特點，成為廣大市民最喜愛、最普遍食用的水果品種。但值得注意的是，目前我國草莓上登記可供選用的農藥品種少[1]，大多數農藥缺少在草莓上使用的合理建議，亦無安全使用間隔期，從而導致生產中農民憑經驗選用農藥，隨意擴大用藥量、隨時采摘，這對草莓的質量安全以及消費者健康造成巨大隱患。

當今，世界各國對農產品安全問題非常重視，如美國、日本、歐盟等國家或國際組織均制訂了農藥在食品和農產品中的最大殘留限量(MRL)[2]。日本作為我國農產品的主要出口國家，在2005年“肯定列表制度”實施后，我國出口日本的植物源性農產品中農藥超標比例逐漸增加[3]。農藥殘留問題已經成為國外限制我國農產品出口的新一輪技術壁壘。因此，開發一種簡單快速、準確穩定、可用于草莓中多種農藥殘留量檢測的方法，不僅對全面加強草莓中的農藥污染監測和監管，保障草莓產業健康發展具有重要意義，還可為我國農產品對外出口提供有力的技術支撐。

目前，針對草莓中農藥殘留的檢測方法有氣相色譜法[4-7]、液相色譜法[8]、氣相色譜-串聯質譜法(GC- MS/MS)[9- 10]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[11-12]、液相色譜-串聯飛行時間質譜法[13]、氣相色譜-串聯飛行時間質譜法[12]等，但氣相色譜法和液相色譜法易受雜質干擾，且檢測時間較長。液相色譜/氣相色譜-串聯飛行時間質譜對儀器要求較高、儀器靈敏度低，對大多數殘留而言很難實現實驗室測定。液相色譜-串聯質譜法因具有高分辨、高通量、高靈敏度等特點，成為近年來農藥多殘留檢測技術的主流方向[11-14]。本研究選擇19種在草莓實際生產中應用最為廣泛的殺蟲、殺菌劑進行研究，這些目標化合物中，僅啶蟲脒、多菌靈、聯苯肼酯、嘧菌環胺、氯蟲苯甲酰胺和啶酰菌胺建立了在草莓上的最大殘留限量[15]，且其中溴氰蟲酰胺等農藥并未涵蓋在現行的GB/T 27069[16]之中，因此，本方法的建立將對評價草莓中農藥殘留膳食安全提供有力的技術支持。

本文通過比較不同前處理方法的凈化效果，建立了一種利用超高效液相色譜-串聯質譜同時測定草莓中19種農藥的多殘留檢測方法。該方法簡單、快速，靈敏度與準確度完全滿足果蔬中農殘檢測要求。

1　實驗部分

1.1材料與設備

1290超高效液相色譜儀、G6460 三重四極桿質譜儀、6530四極桿-飛行時間質譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；T18 ULTRA-TURRAX高速勻漿機(德國IKA集團)。

19種農藥標準品中除蟲脲的純度為97%，其余均為98%。乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；PSA固相萃取柱(500 mg/6 mL)、NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Florisil固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)、PC-NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、商品化QuEChERS凈化管(天津艾杰爾公司)；0.22 μm有機相針筒式濾膜(天津艾杰爾公司)；草莓購于當地農貿市場。

1.2標準溶液配制

1.2.1標準儲備溶液準確稱取適量標準物質，用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標準儲備液，-20 ℃保存，有效期1年。使用時逐級稀釋。

1.2.2混合標準溶液準確移取0.5 mL單標儲備液(雙炔酰菌胺、聯苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯各吸取0.05 mL)于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 mg/L的混合標準溶液。4～6 ℃保存，有效期6個月。

1.3樣品前處理

1.3.1提取準確稱取20 g(精確至0.1 g)樣品至250 mL三角瓶中，加40 mL乙腈，在高速勻漿機中勻漿1 min，收集濾液至裝有5～7 g NaCl的200 mL具塞量筒中，蓋上蓋子后，劇烈振蕩1 min，室溫下靜置1 h。取上清液10 mL，于40 ℃水浴條件下氮氣吹至近干，殘渣用2 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶解，待凈化。

1.3.2凈化NH2固相萃取柱用5 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)活化，再將樣品轉移至固相萃取柱中，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗滌樣品瓶，每次4 mL，洗滌2次，并將洗滌液全部轉入固相萃取柱中，收集全部流出液。將其在40 ℃水浴條件下氮氣吹至近干后，用5 mL乙腈復溶，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

1.4色譜與質譜條件

色譜柱：Agilent Proshell120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm)；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；以0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)為流動相。線性梯度洗脫程序：0 ～5 min，5% ～50% B；5 ～7 min，50%～75% B；7 ～8.5 min，75%～80% B；8.5～9 min，80%～95% B；9～13 min,95%B。

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式電離；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L/min；霧化氣壓力：0.28 MPa；毛細管電壓：3 000 V(ESI+)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：7 L/min。采用多反應監測(MRM)方式檢測，各化合物的監測離子、碰撞能量、碎裂電壓等參數見表1。

2　結果與討論

2.1儀器條件的優化

2.1.1質譜條件的優化以甲醇-水(50∶50)為流動相，采用單針進樣方式，對19種目標農藥的質譜條件進行優化，在電噴霧正、負離子模式下進行全掃描，選擇合適的準分子離子峰和電離方式。根據化合物的響應，以準分子離子為母離子，進行二級質譜掃描，以兩個響應信號穩定的子離子作為定性子離子，其中響應信號較強的子離子作為定量子離子，并優化得到最佳碎裂電壓和碰撞能量。最后，結合基質空白溶液和基質標準溶液的離子掃描圖，進一步優化參數，確定各農藥在MRM模式下的質譜采集參數(見表1)。

表1　MRM監測模式下19種農藥的質譜采集參數

*quantification ion

2.1.2色譜條件的優化考察了0.1%甲酸水-甲醇(A)、0.1%甲酸水-乙腈(B)、0.2 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(C)和0.2 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈(D)4種流動相體系對19種目標農藥的分離效果和離子化效率。結果顯示，當流動相為C和D時，茚蟲威、除蟲脲和多菌靈的儀器響應較低，乙酸銨的加入具有明顯的抑制離子化效果；而當使用A和B流動相時，19種目標化合物的響應明顯高于C和D流動相時的響應，這與甲酸有利于正離子模式質譜分析的理論相吻合，相對而言乙酸銨則有利于負離子模式的質譜分析。此外，以乙腈作為流動相時，氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威、聯苯肼酯、螺螨酯和噠螨靈的儀器響應明顯高于甲醇流動相。因此，最終選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

進一步研究發現，流動相的梯度洗脫對目標農藥的色譜峰信號強度有很大影響，如粉唑醇、雙炔酰菌胺和啶酰菌胺等大部分農藥隨著保留時間的延后，響應值有1.5～3倍的增強。原因可能與雜質分離或者電離時溶劑的比例有關。

在優化的梯度洗脫條件下，19種農藥能夠在12 min內完成分離與檢測。優化條件下，空白草莓樣品加標的總離子流圖見圖1。

2.2凈化方法的選擇

對比了6種凈化方式的凈化效果。方法1：PSA凈化柱，乙腈作為洗脫劑；方法2：Florisil凈化柱，乙腈-甲苯(3∶1)作為洗脫劑；方法3：NH2凈化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作為洗脫劑；方法4：PC-NH2凈化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作為洗脫劑；方法5：QuEChERS(參照AOAC 2007.01方法)；方法6：Mini-Luke方法[17]。

運用上述6種處理方法凈化草莓空白樣品，以UPLC-Q-TOF進行一級質譜掃描。結果顯示，在目標化合物出峰時間段，凈化方法1～4的干擾物明顯少于方法5和6。根據分子特征查找化合物發現，按照方法6凈化得到的樣品中共萃物高達6 042種之多，方法5得到的共萃物也有4 924種，其他4種方法的凈化效果相當，共萃物在2 000～3 000種之間。

在此基礎上，采用1～4凈化方法對19種目標農藥在草莓樣品中進行加標濃度為0.01 mg/kg的回收率實驗。結果表明，方法1和3可使90%以上的目標農藥得到滿意的回收率；而方法2和4則只有70%目標農藥的回收率在70%以上，其中以吡蚜酮差別尤為明顯，在用Florisil柱或PC-NH2柱凈化時，回收率為零，而用PSA柱或NH2柱凈化時，回收率則均在70%以上。此外，相比方法3而言，方法1的成本較高，洗脫劑的毒性較大，因此，實驗最終選擇NH2柱作為固相萃取柱，采用二氯甲烷和甲醇(95∶5)為洗脫劑進行樣品前處理，此時方法的背景干擾最小，有利于保護儀器，減少共萃物對目標農藥的電離影響，同時環境成本和耗材成本最低。

2.3方法評價

2.3.1基質效應的影響基質效應是指從樣品中與目標物同時提取出的共萃物對目標物分析產生的影響和干擾，包括基質增強效應和基質減弱效應。在LC-MS/MS檢測過程中，基質減弱效應更為常見，這與離子的抑制作用有關[18]。基質效應通常與基質種類、目標分析物的特性、色譜分離條件等有關，可按照下式[19]進行量化評估：

弱基質效應(|Mi|<20%)時，無需采取補償措施，而中等程度基質效應(20% ≤|Mi|≤50%)或強基質效應(|Mi|>50%)時，必須采取補償措施[20]，通常采用基質匹配標準溶液校正法和樣品稀釋法。

按照“1.3”進行前處理，“1.2”配制的混合標準溶液用基質空白溶液稀釋至0.1 mg/L,并用乙腈配制同濃度的純溶劑標準溶液，按上述公式進行基質效應的量化評估，結果見表2。在草莓基質中，噠螨靈和螺螨酯顯示中等基質減弱效應(Mi分別為-33.4%和-23.1%)，其他17種目標農藥均為弱基質效應。這說明使用NH2固相萃取柱和合適的洗脫劑比例，使得極性共萃物洗脫的可能性大大降低。

2.3.2線性范圍、準確度及精密度配制一系列不同濃度的基質匹配標準溶液，優化條件下進行處理，以加標回收的方法確定化合物的定量下限(LOQ)。結果顯示，雙炔酰菌胺、聯苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的LOQ為0.001 mg/kg，其余15種農藥為0.01 mg/kg。在0.000 5～1.0 mg/L范圍內，19種目標農藥基質匹配標準溶液的濃度與對應峰面積呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.999。以實際進樣時標準溶液能夠出峰的最小濃度計算檢出限(LOD)，結果見表2。

表2　草莓中19種農藥的檢出限、線性范圍、平均回收率、相對標準偏差及基質效應

通過加標回收實驗，評價本方法的準確度和精密度。結果顯示，在高、中、低3個不同加標濃度下，平行5次實驗，19種目標化合物的平均回收率為77.3% ～100.3%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～12.3%(見表2)，表明方法具有良好的準確度與精密度。

2.4方法的應用

采用本方法對采自上海郊區農貿市場的50個草莓樣品進行檢測，結果如表3所示。其中檢出多菌靈、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺、啶酰菌胺、聯苯肼酯、氟硅唑、吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噠螨靈和茚蟲威共10種農藥。參照GB2763-2014《食品中最大殘留限量標準》[15]，其殘留均未超出最大限量(MRL)。

表3　草莓樣品中農藥的殘留情況

-：not formulated(未制定) ;*temporary maximum residue limits(臨時最大殘留限量);ND：not detected(未檢出)

3　結　論

本文建立了同時測定草莓中19種農藥的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法，該法的線性關系良好，適用性和可操作性強，定量下限低于目前國內外的最大殘留限量要求，符合殘留檢測要求，可用于草莓中農藥殘留水平的評估。

[1]Institute for the Control of Agrochemicals.Registered Data(農業部農藥檢定所.農藥登記數據).[2015-11-10].http://www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index.jhtml.

[2]Wang N N.The Limit Standards for Pesticides and Veterinary Drugs Residues in Food of the Main Trade Countries and Regions.Beijing:China Standard Press(王霓霓.主要貿易國家和地區食品中農獸藥殘留限量標準(第二版).北京:中國標準出版社),2010.

[3]Yuan Q,Qin Y F,Ying S T,Yao H J,Zhang Q H.Pesticides(袁清,覃雅芳,應珊婷,姚晗珺,章強華.農藥),2013，52(11):790-792.

[4]Zhao E C,Zhu X D,Zheng Z T,Jia C H,Yu P Z,He M.Chin.J.Pestic.Sci.(趙爾成,朱曉丹,鄭尊濤,賈春虹,余蘋中,賀敏.農藥學學報),2015，17(1):75-82.

[5]Ma J L,Yang B D,Zhang Z Y,Ge W X,Cui G F,Sun S L,Wang J Z.Pesticides(馬俊嶺,楊寶東,張志勇,戈文學,崔高峰,孫淑玲,王進忠.農藥),2014，53(5):346-349.

[6]Yang Z H,Wei C J,Jia L F,Liang D,Zhao J Z.J.Agro-Environ.Sci.(楊振華,魏朝俊,賈臨芳,梁丹,趙建莊.農業環境科學學報),2013，32(4):697-700.

[7]Yuan S,Zhao J Z,Cai H M,Jia L F,Liang D,Wei C J.J.FoodSaf.Qual.(袁爍,趙建莊,蔡慧敏,賈臨芳,梁丹,魏朝俊.食品安全質量檢測學報),2014，5(9):2869-2876.

[8]Yang L L,Jin F,Du X W,Wu R N,Zhang P,Shi M Q,Wang J.Chin.J.Pestic.Sci.(楊莉莉,金芬,杜欣蔚,烏日娜,張鵬,石夢琪,王靜.農藥學學報),2015，17(4):455-461.

[10]Fernandes V C,Domingues V F,Mateus N,Delerue-Matos C.J.Chromatogr.Sci.,2014,52(10):1339-1345.

[11]Wu S C,Yu M.Chin.J.HealthLabTechnol.(吳淑春,虞淼.中國衛生檢驗雜志),2015，25(9):1301-1306.

[12]Fernandes V C,Lehotay S J,Geis-Asteggiante L,Kwon H,Mol H G J,van der Kamp H,Mateus N,Domingues V F,Delerue-Matos C.FoodAddit.Contam.A,2014，31(2):262-270.

[13]Taylor M J,Keenan G A,Reid K B,Fernández D U.RapidCommun.MassSpectrom.,2008，22(17)：2731-2746.

[14]Sun C X,Cang T,Wang Z W,Wang X Q,Yu R X,Wang Q,Zhao X P.Environ.Monit.Assess.,2015，187(5):303.

[15]GB 2763-2014.National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food.National Standards of the People's Republic of China(食品中農藥最大殘留限量標準.中華人民共和國國家標準).

[16]GB/T 27069-2008.Determination of 450 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables—LC-MS-MS Method.National Standards of the People's Republic of China(水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法.中華人民共和國國家標準).

[17]Multiresidue Method Using Mini-Luke followed by GC-QqQ-MS/MS for Fruits and Vegetables.European Union Reference Laboratory for Pesticides Residues & Vegetables.

[19]Wang C B,Huang X G,Fan X Q,Wu A J,Gao Y D.ActaAgric.Shanghai(汪傳炳,黃秀根,樊曉青,吳愛娟,高永東.上海農業學報),2013，29(4):36-41.

[20]Watanabe E,Kobara Y,Baba K,Baba K,Eun H.FoodChem.,2014，154:7-12.

Determination of 19 Pesticides Residues in Strawberries by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Lin1,HUANG Lan-qi1,CHEN Jian-bo1,YIN Jun2,ZHAN Xiu-ping1,ZHAO Li*

(1.The Ministry of Agriculture Pesticide Quality Supervision and Inspection Testing Center(Shanghai)，Shanghai Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai201103,China;2.Shanghai Municipal Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai2012021,China )

A solid phase exaction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of 19 pesticides in strawberry.After extraction with acetonitrile,purification with NH2SPE cartridges and dissolution with methanol,the analytes were analyzed by UPLC-MS/MS on an Agilent Proshell120 EC-C18column with a mixture of 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase by gradient elution.The mass spectrometer was operated in multiple reactions monitoring(MRM) mode in positive mode.The purifying effects of 6 pretreatment methods were optimized by UPLC-Q-TOF.Matrix effects of real strawberries were studied.The limits of quantitation(LOQs),which were determined by adding standard solution to pesticide-free strawberry samples,were 0.001 mg/kg for mandipropamid,bifenazate,picoxystrobin and pyraclostrobin and 0.01 mg/kg for the others.Good linearities were obtained for 19 pesticides in the concentration range of 0.000 5-1.0 mg/L with correlation coefficients more than 0.999.The fortified recoveries at low,intermediate and high concentration levels were in the range of 77.3%-100.3%,with relative standard deviations(RSDs) not more than 12.3%.False positive results were avoided effectively due to the method’s good ablity of resistence matrix interference.All the above observations indicated that the established method was simple,efficient and sensitive,and was suitable for the determination of 19 pesticides in strawberry.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE);pesticides;residue;strawberry

2015-11-10；

2015-12-16

上海市農委科技攻關項目(滬農科攻字(2013)第3-2號)

趙莉，碩士，高級農藝師，研究方向：農產品安全監管，Tel：021-64052181，E-mail：zhaoli5741@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.011

O657.65;F767.2

A

1004-4957(2016)06-0698-06