UPLC-MS法同時測定牛奶中磺胺類、喹諾酮類、甾體激素類及四環素類獸藥殘留

李　寧，張玉龍，林　濤，王繼良，劉宏程*

(1.昆明醫科大學　藥學院，云南　昆明　650500；2.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南　昆明　650223)

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UPLC-MS法同時測定牛奶中磺胺類、喹諾酮類、甾體激素類及四環素類獸藥殘留

李寧1,2，張玉龍1,2，林濤2，王繼良1，劉宏程2*

(1.昆明醫科大學藥學院，云南昆明650500；2.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南昆明650223)

建立并優化了同時測定牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類以及1種四環素類藥物共25種獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品中目標藥物經5%乙酸乙腈提取，HLB固相萃取小柱凈化后，通過UPLC-MS測定，外標法定量。25種獸藥在不同加標濃度下的回收率為61.6%～119.2%，組內相對標準偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%，方法檢出限為0.5～2.0 μg/kg。

超高效液相色譜-串聯質譜；牛奶；獸藥殘留；磺胺類；喹諾酮類；甾體激素類；四環素類

作為現代人們生活中不可或缺的食品之一，牛奶的營養價值得到了廣泛認可和推崇。但部分生產者為了控制奶牛疾病，盲目而大量地使用各類獸藥，長此以往造成細菌和病毒產生耐藥性，導致只能增大劑量或同時使用多種藥物，形成了惡性循環。還有一些生產者為了增加產量和提高生產效率，對奶牛使用各種甾體激素類藥物，而該類藥物的脂溶性較大，易分泌進入牛奶中，成為直接導致兒童性早熟及性發育異常的重要因素[1-2]。我國農業部235號公告僅對5種甾體激素類藥物的殘留限量做出了規定[3]，鑒于生產者用藥的多樣性及復雜性，建立一種能夠同時快速測定多種獸藥殘留的分析檢測方法勢在必行。

目前國內牛奶中獸藥殘留的檢測方法大多是針對抗菌抗病毒藥物[4-9]，也有部分檢測甾體激素類藥物的報道[10-13]，但鮮有同時檢測抗菌藥物與甾體激素類藥物的方法，尤其是本實驗中3類(磺胺類、喹諾酮類、四環素類)廣泛使用的抗菌代表性藥物與危害性日漸增長的甾體激素類藥物同時檢測的方法。

超高效液相色譜法因其分離效率高、柱效高、耗液少等優點受到了研究者的青睞[14]。本研究采用的Waters QDa質譜檢測器可與色譜分析儀器完美兼容，且經過預先優化，可在穩定處理各種分析的同時降低意外共流出物或成分所帶來的風險。該儀器方法將保留時間和質譜分析相結合，為化合物鑒定提供了更優的分析選擇性，可在無需高端質譜儀的情況下提供分子信息和高質量定性質譜數據，采用SIR選擇性檢測模式可實現可靠的定量檢測。通過質譜檢測分析確認痕量成分，進而提升分析的質量和效率，實現完整快速的色譜分離及化合物鑒定，簡化了實驗室藥品分析的工作流程。實驗通過優化建立了一種能夠同時快速測定多種抗菌藥物及甾體激素類藥物的分析檢測方法，給日常分析檢測工作提供借鑒的同時為國家制定食品安全限量標準及檢測方法提供了參考。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Waters H-class超高效液相色譜儀、QDa質譜儀、BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱均購自美國Waters公司，電子天平(瑞士梅特勒公司)，渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，氮氣吹干儀(美國Organomation Associates)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)，乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制25種標準藥物儲備溶液:準確稱取每種標準物質適量，用甲醇配成100 μg/mL的標準儲備溶液，于4 ℃冰箱保存。

25種標準藥物混合標準溶液:準確移取適量每種標準儲備溶液混合，用甲醇配成10 μg/mL的標準儲備溶液，于4 ℃冰箱保存。

Na2EDTA緩沖溶液:準確稱取1.29 g檸檬酸、1.09 g磷酸氫二鈉、3.72 g Na2EDTA-2H2O，加超純水90 mL溶解，用氫氧化鈉固體調至pH 6.0左右，定容至100 mL保存備用。

1.2.2樣品前處理樣品制備:購于超市的純牛奶于4 ℃下保存備用。

提取:稱取5 g牛奶試樣于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA緩沖溶液(pH 6.0)，渦旋混勻1 min，45 ℃水浴超聲3 min，加入10 mL 5%乙酸乙腈和2 g氯化鈉、4 g無水Na2SO4，渦旋混勻1 min，超聲提取5 min，5 000 r/min高速離心5 min，取上清液待凈化。

凈化:移取上清液于10 mL具刻度玻璃管中，40 ℃下氮氣濃縮至近干，加入5 mL 緩沖液溶解稀釋，待上樣。HLB固相萃取小柱依次經6 mL甲醇、6 mL水、3 mL緩沖溶液活化，取稀釋液上樣，6 mL水淋洗，正壓擠干或負壓抽干小柱，8 mL甲醇-乙酸乙酯洗脫液(3∶7)洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮氣濃縮吹干，1 mL甲醇定容，渦旋混勻1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3超高效液相色譜-質譜條件超高效液相色譜條件:C18高效液相色譜柱(Waters BEH C181.7 μm×2.1 mm×50 mm)；載氣為高純氮氣(≥99.999%)；流動相:A為甲醇，B為含10 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積1 μL；梯度洗脫步驟為:0～1 min，0～10%A；1～6 min，10%～60%A；6～7 min，60%～80%A；7～8 min，80%～10%A。

質譜條件:檢測器:Waters QDa質譜儀；離子源:ESI源；掃描方式:正離子SIR掃描；掃描質量數范圍為m/z30～500；采樣速率8點/s；毛細管電壓:0.8 kV；錐孔電壓:15 V。

2　結果與討論

2.1色譜及質譜條件的優化

本實驗選用BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱分離目標化合物以達到有效分離的目的。由于磺胺類、喹諾酮類和四環素類藥物均呈酸堿兩性，流動相pH值對保留和分離的影響大。實驗比較了甲醇-水和乙腈-水作流動相時的峰形和響應，以及甲酸、甲酸銨和乙酸銨的離子化效率，發現甲醇-0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L乙酸銨)作流動相時離子化效率高，峰形好，響應較高(見圖1)。酸度過低會出現峰拖尾，過高則分離效果差。

本實驗采用Waters QDa質譜檢測器，操作簡便，能夠降低共流出物或基質本身的干擾，雖然靈敏度與三重四極桿質譜儀有一定的差距，但與紫外檢測器相比，能夠明顯減少雜質峰，同時可在較短的時間內完成儀器的自檢及調諧，快捷方便，基本能滿足常規檢測要求。

2.2提取條件的優化

目標化合物均易溶于丙酮、乙腈等非極性或中等極性溶劑，而乙腈具有較好的蛋白沉淀作用，有利于提取，因此選用乙腈作為提取溶劑，且以5%酸化乙腈對目標化合物的提取更優。當僅用酸化乙腈提取時發現喹諾酮類和四環素類藥物基本未檢出，這是由于喹諾酮類藥物分子結構中的3-羧基和4-羰基可與Ca2+,Mg2+,Al3+,Zn2+等金屬離子螯合，四環素類藥物同樣容易與金屬離子螯合而影響提取效果，所以考慮加入EDTA緩沖溶液。一方面EDTA緩沖液可與基質中的金屬離子螯合而使目標化合物分布到有機相中，且實驗發現超聲水浴30～40 ℃對EDTA和金屬離子的螯合置換過程有一定幫助；另一方面，緩沖溶液起到了稀釋基質的作用，一定程度上減小了基質效應的影響。同時，實驗發現緩沖溶液的pH值對提取效果有很大影響，分別考察了pH 4.0，7.0，9.0時的提取效果。結果發現，由于磺胺、喹諾酮和四環素均屬于兩性化合物，因此過酸和過堿都不利于提取，而pH值對雌激素的影響則較小。此外，酸堿環境對3類化合物的影響大小也不同，其中酸性環境對于磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的影響大于堿性環境，而四環素類藥物則反之。在近中性條件下，目標化合物更易與金屬離子形成不溶性絡合物，因此最終選擇pH 6.0的EDTA緩沖溶液進行后續考察。

2.3凈化條件的優化

2.4線性范圍與檢出限

在最佳儀器條件下，配制不同濃度的標準工作液，以定量離子峰面積對其濃度進行線性回歸分析，并繪制標準曲線。以牛奶空白基質進行檢出限(LOD=3m1h0/(m0h1)，m1和h1分別表示加標量和化合物峰高；m0和h0分別表示牛奶基質量和基線高度)和定量下限(LOQ=3LOD)計算，結果如表1所示。25種目標藥物在1～50 μg/kg濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.99，LOD為0.5～2.0 μg/kg，LOQ為1.5～6.0 μg/kg。

表1　25種目標藥物的線性范圍、相關系數、檢出限及定量下限

2.5回收率與精密度

以鮮牛奶和普通牛奶進行加標回收和精密度實驗，分別以1LOQ,5LOQ和10LOQ作為加標水平，每個水平平行試驗6次，結果如表2所示。25種目標藥物的平均回收率為61.6%～119.2%，組內相對標準偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%。鮮牛奶的回收率普遍低于普通純牛奶，分析其原因可能與蛋白量、含鈣量等基質成分有關，但基本滿足日常分析對牛奶中目標藥物的測定要求。

表2　25種獸類藥物不同加標水平下的回收率及相對標準偏差

(續表2)

2.6實際樣品的測定

隨機抽取在售的鮮牛奶和純牛奶各18份，采用本方法測定，在1份純牛奶樣品中檢出磺胺間二甲氧嘧啶21.5 μg/kg，1份純牛奶樣品中檢出磺胺甲基嘧啶10.6 μg/kg、恩諾沙星15.3 μg/kg，但均未超過我國農業部限量標準；1份鮮牛奶樣品中檢出孕酮4.5 μg/kg，我國農業部未對其作出限量規定，但未超過美國規定的5 μg/kg限量標準，其他樣品未見檢出。

3　結　論

本研究建立了牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類和1種四環素類共25種獸類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法，優化了固相萃取法的樣品前處理條件。該方法操作較簡便，靈敏度高，可滿足牛奶中25種獸類藥物的痕量分析要求，尤其適于實驗室外的分析檢測。

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Analysis of Sulfonamide,Quinolones,Steroid Hormones and Tetracyclines Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LI Ning1,2，ZHANG Yu-long1,2，LIN Tao2，WANG Ji-liang1，LIU Hong-cheng2*

(1.School of Pharmaceutical Science,Kunming Medical University,Kunming650500,China；2.Institute of Agricultural Quality Standard & Testing Technique,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming650223,China)

A comprehensive method was developed and optimized for the simultaneous analysis of sulfonamides,quinolones,steroid hormones and tetracycline by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The veterinary drugs in milk samples were extracted with 5% acetic acid-acetonitrile solution,and then the mixture was centrifuged.The supernatant was purified with an HLB solid phase extraction column,and analysed by UPLC-MS and quantified by the external standard method.Average recoveries of 25 veterinary drugs at three spiked levels ranged from 61.6% to 119.2% with relative standard deviations(RSDs) of 2.5%-13.4%.The method limits of detection(LOD) for target compounds were in the range of 0.5-2.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS);milk;veterinary drugs residues；sulfonamides;quinolones；steroid hormones;tetracycline

2015-11-25；

2015-12-16

云南省科技惠民計劃(2013RA012)；云南省科技創新平臺建設計劃(2014DA001)

劉宏程，博士，研究員，研究方向:農產品質量安全，Tel:0871-65160403，E-mail:liuorg@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.014

O657.63;O629.8

A

1004-4957(2016)06-0714-05