大體積進樣-非勻強電場掃集微乳毛細管電動色譜法測定化妝品中糖皮質激素

郭成方，商少明，劉俊康，沈　潔，孫雪婷，何勝俊

(江南大學　化學與材料工程學院　食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇　無錫　214122)

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大體積進樣-非勻強電場掃集微乳毛細管電動色譜法測定化妝品中糖皮質激素

郭成方，商少明*，劉俊康，沈潔，孫雪婷，何勝俊

(江南大學化學與材料工程學院食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

建立了一個簡單有效的微乳毛細管電動色譜(MEEKC)在線富集-大體積進樣(LVSI)與非勻強電場掃集(REFS)聯用測定化妝品中4種糖皮質激素(潑尼松、氫化可的松、潑尼松龍和倍他米松)的方法。MEEKC的緩沖體系組成為:2.4%SDS,0.6%正辛烷,6.6%正丁醇,30 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)，分離電壓為9.6 kV，進樣壓力為12.3 kPa，進樣時間為95 s，檢測波長為230 nm。在最優實驗條件下，4種糖皮質激素的富集倍數為853～933倍，在0.015～14 mg/L范圍內呈線性關系，檢出限(S/N=3)為4～8 μg/L。應用此方法分析了化妝品樣品,回收率為93.7%～103.8%，相對標準偏差(n=5)均不大于4.4%。

微乳毛細管電動色譜；在線富集；大體積進樣；掃集；化妝品；糖皮質激素

糖皮質激素(Glucocorticoids)是一類由腎上腺皮質分泌的甾類激素，潑尼松(PS)、氫化可的松(HC)、潑尼松龍(PL)和倍他米松(BT)是腎上腺皮質激素類藥物，具有重要的生理活性，如抗炎及抗過敏，降低毛細血管壁和細胞膜的通透性，減少炎性滲出等作用。化妝品中加入糖皮質激素可起到美白保濕的效果,但長期使用含有糖皮質激素的化妝品會產生面部毛囊萎縮、毛細血管擴張等副作用[1]，對人體面部皮膚造成嚴重損害。我國《化妝品規范》[2]中明確規定糖皮質激素為化妝品中禁用組分。因此，建立化妝品中糖皮質激素的經濟、快速和高靈敏的檢測方法對于化妝品的質量控制，確保化妝品的使用安全具有重要意義。

糖皮質激素的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-5]、固相萃取/液相色譜法(SPE/HPLC)[6-7]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[8-9]和毛細管電泳法(CE)[10-12]等。相比之下，CE法具有快速、高效、耗樣量少等特點。CE通常使用紫外檢測器，為了減小譜帶擴張,紫外檢測主要采用柱上檢測的方法,然而，由于毛細管內徑較小，紫外檢測的靈敏度受到很大限制。因此，對于化妝品中微量和痕量糖皮質激素檢測，傳統的CE法很難滿足要求。目前,通過在線富集技術提高靈敏度的方法已頗受重視，該技術可通過對樣品、運行緩沖液的組成以及進樣程序進行簡單的調控提高靈敏度，無需對商品儀器進行改造，而且富集效果好。

微乳毛細管電動色譜(MEEKC)是20世紀90年代發展起來的一種電泳新技術[13]，該技術一般采用水包油型微乳液作為分離介質，對中性物質具有良好的分離效果。但MEEKC在線富集的方法報道較少[14-16]。本研究建立了大體積進樣-非勻強電場掃集微乳毛細管電動色譜法(LVSI-REFS/MEEKC)同時檢測化妝品中4種糖皮質激素的方法，與常規CE相比，方法靈敏度提高了3個數量級。本方法操作簡單、樣品用量少、分析快速，具有良好的分離度和靈敏度。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

TH-3100型高效毛細管電泳儀(保定天惠分離科學研究所)，配紫外檢測器和溫控裝置；未涂層毛細管(河北永年瑞灃光導纖維廠，65 cm×50 μm，有效長度50 cm)；分析天平、EF20 pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；SK2200H 超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；Milli-Q Refrence 超純水機(美國Millipore公司)；旋轉蒸發儀(鞏義市英峪高科儀器廠)；DDS-307電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

潑尼松(PS)、氫化可的松(HC)、潑尼松龍(PL)、倍他米松(BT)標準品(上海安譜科學儀器公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、硼砂、HBO3、NaH2PO4、NaOH、正丁醇、正辛烷、甲醇(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)。化妝品樣品購于本地超市。實驗用水為超純水。

1.2溶液的制備

1.2.1標準溶液的配制準確稱取PS，HC，PL，BT標準品，用甲醇配制成2 mg/mL的儲備液，避光4 ℃保存。使用時根據需要稀釋成不同濃度的標準溶液。

1.2.2樣品溶液制備準確稱取化妝品樣品1.0 g于50 mL離心管內，向其中加入15 mL甲醇,充分振蕩5 min,超聲20 min,再加入10 mL正己烷,振蕩10 min,以8 000 r/min離心8 min,棄去上層正己烷層；再加入10 mL正己烷重復上述操作，下層甲醇溶液在45 ℃下減壓濃縮至約1 mL。以樣品基質溶液定容至10 mL，即得樣品溶液。

1.3實驗條件

1.3.1電泳條件緩沖體系：2.4% SDS,0.6% 正辛烷,6.6% 正丁醇，30 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)；檢測波長為230 nm；環境溫度20 ℃。

1.3.2LVSI-REFS/MEEKC條件分離電壓為9.6 kV，采用壓力進樣，進樣壓力12.3 kPa，進樣時間95 s。

1.3.3毛細管沖洗方法在實驗前，依次用0.1 mol/L鹽酸溶液、超純水、1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、運行緩沖溶液沖洗10 min。兩次樣品分析運行期間，分別用1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、運行緩沖溶液沖洗5 min，以獲得良好的分離檢測重現性。

1.4LVSI-REFS/MEEKC的分離富集模式

LVSI-REFS/MEEKC的分離過程見圖1。樣品溶液中不含微乳粒子但電導率高于運行緩沖液(BGS)。毛細管中先充滿含有微乳粒子的運行緩沖液，然后在入口端以壓力進樣方式引入一段樣品溶液(圖1A)。施加正電壓后(毛細管兩端插入BGS中),運行緩沖液中帶負電荷的微乳粒子從陰極端向陽極端遷移,在運行緩沖液和樣品界面上發生微乳堆積(圖1B)。堆積的微乳粒子穿過樣品區帶并將分析物掃集到一個較窄的區域(圖1C)。由于電滲流(EOF)的速度大于帶負電微乳粒子的淌度(μ)，被掃集的樣品區帶在EOF的作用下向陰極移動，富集后的分析物以MEEKC模式進行分離(圖1D)。

2　結果與討論

2.1運行緩沖液與樣品溶液電導率差異的影響

運行緩沖液和樣品溶液的電導率差異對富集效率影響很大。分別考察了運行緩沖液(pH 8.2)和樣品溶液(pH 3.6)電導率差異對富集效果的影響(見表1)。由表可知，運行緩沖液的電導率低于樣品溶液的電導率時，4種激素的富集效果較好。這是由于毛細管兩端施加相同的電壓，運行緩沖液的電導率低，電場強度大，帶電的微乳粒子在運行緩沖液中遷移速率較快，遇到低電場強度的樣品區帶，微乳粒子在接界處堆積進而抵擋了掃集后堆積樣品區帶的展寬，從而實現了較好的富集效果。

表1　運行緩沖溶液和樣品溶液電導率差異的影響

2.2SDS濃度的影響

SDS濃度是影響MEEKC分離和富集的重要因素。考察了SDS濃度分別為1.2%，1.8%，2.4%，3.0%，5.4%時對分離富集效果的影響。結果顯示，在較低的SDS濃度(1.2%)下，分析物的分離度和富集效果較差，隨著SDS濃度的增加，分析物的保留時間延長，分離度明顯改善，峰高增加，SDS濃度為2.4% 時峰高達到最大值。隨著SDS濃度繼續增加，電流增大，產生的焦耳熱增多，導致峰高逐漸降低。且在SDS濃度為5.4%時，基線不平穩。綜合考慮，選擇SDS的最佳濃度為2.4%。

2.3運行緩沖液的pH值與濃度的影響

運行緩沖液的pH值對富集效果和分析時間影響很大。考察了運行緩沖液的pH值在7.4～9.0范圍內對富集效果的影響(圖2)。結果表明，隨著pH值的增加，分析時間逐漸減少，這是由于pH值的升高引起電滲流增加所致。此外，當pH值小于8.2時,隨著pH值的提高,峰高增加，峰形明顯改善，當pH值大于8.2時，峰高開始降低，并伴有峰展寬。考慮到分析時間和富集效果，實驗選擇pH 8.2為最優值。

同時考察了pH 8.2時不同運行緩沖液的濃度(5，10，20，30，40 mmol/L)對富集效果的影響。實驗結果表明，硼酸鹽緩沖溶液的濃度越低，分離時間越短，但富集效果差；硼酸鹽緩沖溶液濃度越高，分離時間越長,但峰高減小。當硼酸鹽緩沖溶液濃度為30 mmol/L(pH 8.2)時，在25 min內可實現4種激素的基線分離，且富集效果最好。因此，確定硼酸鹽緩沖溶液的最佳濃度為30 mmol/L。

2.4樣品基質溶液濃度的影響

將樣品分別溶解在40～80 mmol/L(pH 3.6)的磷酸鹽緩沖溶液中，考察了樣品基質溶液濃度對富集效果的影響。結果表明，樣品基質溶液濃度為60 mmol/L時，富集效果最好，隨著濃度的降低，分析時間減少，富集效果逐漸變差，這是因為樣品基質溶液濃度降低，樣品區帶的電導率和運行緩沖液的電導率逐漸接近，整個毛細管內形成勻強電場，微乳粒子在樣品區帶和運行緩沖液接界處無法堆積，影響了富集效率。當濃度高于60 mmol/L時，隨著濃度的增加，較高的電導率會使樣品區帶的電場強度隨之增加，而較高的場強使樣品區帶壓縮速度減慢并發生解聚，分析時間延長，富集效率降低。綜合考慮，樣品基質溶液濃度選擇60 mmol/L。

2.5進樣時間的選擇

固定進樣壓力為12.3 kPa，考察了進樣時間分別為70,80,90,95,100，110 s時對峰高的影響。結果表明，隨著進樣時間的延長，峰高明顯增加。但進樣時間超過95 s時，由于進樣量過大導致毛細管過載，出現明顯的峰展寬現象，峰高下降。因此選擇最佳進樣時間為95 s。

2.6富集倍數

在優化條件下，分別采用常規MEEKC和LVSI-REFS/MEEKC方法測得4種糖皮質激素標準品的峰高(圖3)，分別表示為h和H，樣品濃度分別為200，2 μg/mL，則富集倍數fi=(Hi/hi)×(200/2)，由此公式計算出PS，HC，PL，BT的富集倍數分別為853，893，933和925倍。

2.7線性關系與檢出限

配制4種糖皮質激素系列標準溶液，在最優化條件下進行分離分析，以峰高(y)對樣品濃度(x，μg/mL)進行線性回歸，以3倍信噪比(S/N=3)計算得4種分析物的檢出限(LOD)，結果見表2。在最優實驗條件下，4種糖皮質激素在0.015～14 mg/L范圍內呈良好的線性關系，其LODs(S/N=3)達4～8 μg/L。

表2　4種激素的線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限

表3列舉了本方法與其他方法的比較。 HPLC/UV雖然方法穩定，但需消耗大量溶劑，且靈敏度較低;LC-MS具有較高的靈敏度，但儀器價格較為昂貴，且受化妝品樣品基質影響較為嚴重;SPE/HPLC也具有較低的檢出限，但需對樣品進行凈化前處理和離線預富集，操作繁瑣;CE-UV高效快速，但靈敏度較低。而LVSI-REFS/MEEKC采用在線富集技術，樣品前處理簡單，且靈敏度較高，更適合化妝品中微量或痕量激素的檢測。

表3　LVSI-REFS/MEEKC檢測糖皮質激素和其他方法的對比

CS：cortisone;DS：dexamethasone；ACS：acetate-cortisone;BFS：fluticasone propionate;FS：flumethasone;TD：triamcinolone acetonide;BS：budesonide;TAD：triamcinolone acetonide

2.8回收率與精密度

平行稱取經測定不含激素的化妝品試樣2份，其中1份測定其本底值，另1份加入8 μg/L的4種激素混合物，經乳化機高速剪切，充分混勻后，按照本方法進行分析測定，其結果如圖4所示。結果表明，如果化妝品中4種激素的含量在8 μg/L以上，使用該方法均能檢出。另稱取上述試樣5 g，平行5份，分別加入一定質量濃度的混合標準溶液，充分混勻后，按照本方法進行測定，測定結果如表4所示。結果表明，4種激素的平均回收率為93.7%～103.8%，相對標準偏差(RSD)均不大于4.4%。

2.9實際樣品的測定

選擇洗面奶、爽膚水、潤膚霜、沐浴露、洗發水、護發素、粉底液、乳液等11種不同形態的市售及美容院專用化妝品，在優化條件下進行分析測定。結果表明，所選化妝品樣品均未檢出4種分析物。

3　結　論

建立了可同時測定化妝品中4種糖皮質激素的微乳毛細管電動色譜-大體積進樣與非勻強電場掃集聯用方法。該方法前處理簡單，重現性好；通過在線大體積進樣與非勻強電場掃集聯用技術對化妝品中的痕量糖皮質激素進行富集，提高了分析的靈敏度，為化妝品中痕量糖皮質激素的分離測定提供了一種新方法。

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Online Determination of Glucocorticoids in Cosmetics by Large Volume Sample Injection-Reduced Electric Field Sweeping and Microemulsion Electrokinetic Chromatography

GUO Cheng-fang,SHANG Shao-ming*,LIU Jun-kang,SHEN Jie,SUN Xue-ting,HE Sheng-jun

(School of Chemical and Material Engineering，The Ministry of Education Key Laboratory of Food Colloid and Biological Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

A simple and efficient online sample pre-concentration method composed of large volume sample injection(LVSI)-reduced electric field sweeping(REFS) and microemulsion electrokinetic chromatography(MEEKC) was developed for the determination of glucocorticoids(prednisone,hydrocortisone,prednisolone and betamethasone) in cosmetics.The microemulsion background buffer was composed of 2.4%dodecyl sodium sulfate,6.6% butanol,0.6%octane and 30 mmol/L borate buffer(pH 8.2).The separation voltage was 9.6 kV and the sample was injected at 12.3 kPa for 95 s.The detection wavelength was set at 230 nm.Under the optimum conditions，the enrichment factors ranged from 853 to 933.The calibration curves were linear in the concentration of 0.015-14 mg/L.The limits of detection(S/N=3) were in the range of 4-8 μg/L.The developed method was used to analyze corticosteroids in cosmetics with recoveries of 93.7%-103.8%and RSDs(n=5) not more than 4.4%.

microemulsion electrokinetic chromatography；online pre-concentration；large volume sample injection；sweeping；cosmetic；glucocorticoid

2015-10-19；

2016-01-13

國家質量檢驗檢疫監督總局項目(2010IK183)

商少明，博士，副教授，研究方向：光譜分析與分離分析，Tel：0510-85917090，E-mail:smshang@jiangnan.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.009

O657.3;O625.312

A

1004-4957(2016)06-0686-06

研究簡報