低聚苯酰胺蛋白質α-螺旋模擬物的合成

任　揚，周孝湖，趙斯祺，林雨霖，汪　翔，徐　海

(中南大學化學化工學院，湖南　長沙　410083)

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低聚苯酰胺蛋白質α-螺旋模擬物的合成

任揚，周孝湖，趙斯祺，林雨霖，汪翔，徐海

(中南大學化學化工學院，湖南長沙410083)

非肽小分子α-螺旋模擬物的設計與合成是蛋白質相互作用抑制劑研發的一個重要方向。該方法通過設計、合成有機小分子化合物來模擬蛋白質相互作用界面熱點區域(hot-spot)的α-螺旋結構。利用模擬物與相應蛋白質結合，從而阻斷特定蛋白質-蛋白質之間的相互作用，最終達到治療相應疾病的目的。本文以低聚苯酰胺為骨架，設計、合成了以阿司匹林為母體的蛋白質α-螺旋模擬物。

低聚苯酰胺；α-螺旋；模擬物；阿司匹林

蛋白質是生物體的重要組成部分，參與了絕大多數的生命活動和細胞進程。蛋白質-蛋白質相互作用(PPIs)對正常細胞功能的發揮起著至關重要的作用，調節著多種多樣的細胞過程，如細胞生長、信號傳導、細胞凋亡等[1-4]。因此，很多疾病，如癌癥、艾滋病、帕金森綜合癥等都和特定蛋白質-蛋白質之間的相互作用有著密不可分的關系[5-6]。目前，蛋白質-蛋白質相互作用已日益成為一系列疾病的重要靶標。靶向蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑的開發已經成為相關藥物研發的一個重要方向[7-8]。Clackson等[9]通過對蛋白質相互作用進行詳細的熱力學分析和突變研究發現，雖然蛋白質相互作用界面面積較大，但是在蛋白質相互作用界面處的少數氨基酸殘基對蛋白質的結合起到了至關重要的作用。這些關鍵位置的氨基酸殘基貢獻了大部分的結合自由能。這些位置被稱之為蛋白質相互作用的“熱點區域”(hot-spot)[10-12]。

本文設計合成了以阿司匹林為母體低聚苯酰胺為骨架的非肽小分子α-螺旋模擬物來模擬蛋白質的“熱點區域”。阿司匹林，又名乙酰水楊酸，是一種水楊酸藥物，它是世界上使用最廣泛的藥物之一，最初是由化學家霍夫曼合成的，德國拜耳公司在1899年正式生產該藥物[13]，并隨著醫學科學的發展以及對阿斯匹林藥理學作用的機理認識的進一步加深，阿司匹林在臨床上應用越來越廣泛[14]。水楊酸的羥基處于羧基的2號位，如果將其羥基取代，便可制備大量帶不同側鏈的中間體并可廣泛運用于三聚酰胺骨架的α-螺旋模擬物，使這些結構類似水楊酸的中間體不僅可發揮與阿司匹林類似的作用還可以模擬蛋白質的相關性質。

1　α-螺旋模擬物的合成

1.1化合物1的合成

在反應瓶中加入4-硝基-2-羥基苯甲酸甲酯(1 g，5.07 mmol)，無水碳酸鉀(0.7 g，5.07 mmol)，DMF(100 mL)，正溴丁烷(1.03 g，7.6 mmol)90 ℃下氮氣保護反應12 h。反應完畢后，抽濾。向濾液中加入150 mL乙酸乙酯。將混合液用水洗(3×200 mL)，分出乙酸乙酯層，用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸出溶劑。粗產物以石油醚/二氯甲烷=3:1的洗脫劑進行柱層析。得目標產物，黃色油狀液體(0.83 g)，產率為65%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88 (d,J=8.2 Hz, 1H), 7.84～7.78 (m, 2H), 4.14 (t,J=6.4 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 1.90～1.83 (m, 2H), 1.55 (dd,J=15.0, 7.5 Hz, 2H), 1.00 (t,J=7.4 Hz, 3H)。 HRMS: calcd. for C12H15NNaO5276.0848 [M+Na]+; found 276.0738。

圖1　苯環2-取代α-螺旋模擬物的合成

1.2化合物2的合成

將化合物1(1 g，3.95mmol)溶于120 mL四氫呋喃中，稱取氫氧化鋰(0.28 g，11.85 mmol)溶于120 mL水。將氫氧化鋰水溶液倒入溶有化合物1的四氫呋喃溶液中，室溫下攪拌反應5 h。反應完后，減壓蒸出四氫呋喃。殘余液用二氯甲烷洗(3×60 mL)。分出水層，滴加稀鹽酸至pH=3。用二氯甲烷萃取至水溶液澄清。萃取液用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸出溶劑得目標產物，淺黃色固體(0.86 g)，產率為91%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.89 (s, 1H), 8.33 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.95 (dd,J=8.6, 2.1 Hz, 1H), 7.91 (d,J=2.0 Hz, 1H), 4.36 (t,J=6.5 Hz, 2H), 1.97 (tt,J=13.0, 6.5 Hz, 2H), 1.63～1.52 (m, 2H), 1.04 (t,J=7.4 Hz, 3H)。 HRMS: calcd. for C11H13NNaO5262.0691[M+Na]+; found 262.0587。

1.3化合物3的合成

將化合物1(1 g，3.95 mmol)溶于150 mL四氫呋喃中，加入0.2 g 5%Pd/C，通入氫氣，45 ℃下攪拌反應5 h。反應完后抽濾，減壓抽出溶劑。得目的產物灰白色固體(0.86 g)，產率為98%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 6.28～6.14 (m, 2H), 4.24 (s, 2H), 3.94 (t,J=6.5 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 1.85～1.73 (m, 2H), 1.58～1.45 (m, 2H), 0.96 (t,J=7.4 Hz, 3H)。 HRMS: calcd. for C12H17NNaO3246.1106 [M+Na]+; found 246.1040。

1.4化合物4的合成

取化合物2(1 g，4.18 mmol)溶于120 mL二氯甲烷中。加入2-氯-1-甲基吡啶鎓碘(CMPI，3.2 g，12.55 mmol)，三乙胺(1.26 g，12.55 mmol)。50 ℃下氮氣保護攪拌反應10 min。取化合物3 (0.93 g，4.18 mmol)溶于適量二氯甲烷中。將溶液注入反應瓶中，繼續反應5 h。反應完成后減壓蒸出二氯甲烷。剩余物以石油醚/二氯甲烷=1:1的洗脫劑進行柱層析。得目標產物淺黃色固體(1.26 g)，產率為68%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.08 (s, 1H), 8.54～8.38 (m, 1H), 8.03～7.94 (m, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.89～7.80 (m, 2H), 6.85 (dd,J=8.4, 1.9 Hz, 1H), 4.36 (t,J=6.1 Hz, 2H), 4.12 (t,J=6.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.12～2.00 (m, 2H), 1.92～1.82 (m, 2H), 1.67 (dt,J=15.2, 7.5 Hz, 2H), 1.57 (dt,J=14.7, 7.5 Hz, 2H), 1.09 (t,J=7.4 Hz, 3H), 1.02 (t,J=7.4 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.1, 161.4, 160.2, 156.8, 150.6, 142.6, 133.7, 132.8, 126.6, 116.2, 115.7, 110.6, 107.7, 104.7, 70.3, 68.7, 51.8, 31.2, 31.1, 19.3, 19.2, 13.8, 13.7。 HRMS: calcd. for C23H29N2O7445.1975 [M+H]+; found 445.1831。

1.5化合物5的合成

合成和分離方法與化合物3相同。得目標產物灰白色固體，產率為97%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.11 (s, 1H), 8.11 (d,J=8.5 Hz, 1H), 7.89 (d,J=1.6 Hz, 1H), 7.83 (d,J=8.5 Hz, 1H), 6.79 (dd,J=8.5, 1.9 Hz, 1H), 6.51 (d,J=8.6 Hz, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.16 (t,J=6.4 Hz, 2H), 4.11 (t,J=6.5 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 2.02～1.92 (m, 2H), 1.90～1.81 (m, 2H), 1.66～1.51 (m, 4H), 1.08～1.03 (m, 3H), 1.03～0.95 (m, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.3, 163.7, 160.3, 158.5, 144.0, 134.1, 132.7, 114.3, 112.1, 110.3, 108.7, 104.3, 98.7, 69.0, 68.6, 51.6, 31.3, 31.2, 30.3, 19.4, 19.2, 13.8, 13.8. HRMS: calcd. for C23H31N2O5415.2233 [M+H]+; found 415.2143。

1.6化合物6的合成

合成方法與化合物4的合成方法相同。反應完后以石油醚/二氯甲烷=1:5進行柱層析。得目標產物淺黃色固體，產率為70%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.22 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 8.47 (d,J=8.7 Hz, 1H), 8.28 (d,J=8.5 Hz, 1H), 8.15 (d,J=1.8 Hz, 1H), 7.99 (dd,J=8.7, 2.0 Hz, 1H), 7.91 (d,J=2.0 Hz, 1H), 7.88 (d,J=1.8 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.5 Hz, 1H), 6.83 (td,J=8.6, 1.9 Hz, 2H), 4.37 (t,J=6.5 Hz, 2H), 4.32 (t,J=6.5 Hz, 2H), 4.13 (t,J=6.5 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.12～2.00 (m, 4H), 1.91-1.83 (m, 2H), 1.66 (dt,J=15.1, 7.6 Hz, 4H), 1.57 (dt,J=14.7, 7.4 Hz, 2H), 1.10 (dd,J=15.8, 7.5 Hz, 6H), 1.02 (t,J=7.4 Hz, 3H)。13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 166.2, 163.0, 161.5, 160.3, 157.9, 156.9, 150.7, 143.5, 142.7, 133.6, 133.0, 132.7, 126.4, 117.1, 116.2, 114.9, 112.0, 110.5, 107.8, 104.5, 104.1, 70.4, 69.4, 68.6, 51.6, 31.3, 31.2, 31.0, 19.4, 19.3, 19.2, 13.8, 13.8, 13.7。 HRMS: calcd. for C34H42N3O9636.2921[M+H]+; found 636.3737。

1.7化合物7的合成

合成和分離方法與化合物3相同。得目標產物灰白色固體，產率為98%。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.26 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.21 (t,J=8.0 Hz, 2H), 8.07 (d,J=8.5 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.83 (d,J=8.5 Hz, 1H), 6.86～6.80 (m, 1H), 6.71 (d,J=8.6 Hz, 1H), 6.41 (d,J=8.5 Hz, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.28 (t,J=6.4 Hz, 2H), 4.12 (dt,J=13.0, 6.4 Hz, 4H), 3.87 (s, 3H), 1.99 (dd,J=10.9, 8.0 Hz, 4H), 1.90～1.81 (m, 2H), 1.58 (ddd,J=20.5, 15.0, 7.5 Hz, 6H), 1.43 (s, 2H), 1.08～1.02 (m, 6H), 0.99 (t,J=7.4 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.3, 164.0, 163.4, 160.3, 158.6, 158.0, 144.1, 143.8, 134.1, 132.7, 132.7, 115.6, 114.5, 111.6, 110.5, 104.4, 103.7, 69.2, 69.0, 68.6, 51.6, 31.4, 31.3, 31.2, 30.3, 29.7, 19.4, 19.4, 19.2, 13.8, 13.8, 13.7。 HRMS: calcd. for C34H43N3NaO7628.2999 [M+Na]+; found 629.3015。

2　結果與討論

在α-螺旋模擬物的合成過程中有幾點需要特別注意的。首先是以乙酸叔丁酯為側鏈的單體水解步驟中需要注意反應時間不能太長，否則側鏈上的叔丁酯基也會水解掉，使得產率降低。同時，LiOH的量也不能加太多。一般使用3倍當量的LiOH溶于等體積的THF和水的混合溶劑中，室溫下攪拌反應3～5 h即可。反應產率一般在30%左右。而其他側鏈的單體進行水解時可適量多加些LiOH，其反應的產率一般可達80%。

其次，各種α-螺旋模擬物單體和二聚物上硝基還原為氨基的反應需要注意盡量選用大一些的容器。我們一般選用1000 mL或者500 mL的圓底燒瓶。因為大的容器可使反應液與氫氣的接觸面積更大，可縮短反應時間。同時，溶劑不用加太多。另外，在開反應時要用氫氣將反應瓶中的空氣置換掉，因為氫氣的密度比空氣小，如果不置換掉空氣氫氣就不能充分地與反應液面接觸，從而會降低反應產率，延長反應時間。反應時還要使氫氣具有一定的壓力。我們在進行這步反應過程中還嘗試了一些其他的方法，比如以SnCl2·2H2O為還原劑，乙酸乙酯為溶劑反應以及在Pd/C催化下用水合肼還原。其中，以SnCl2·2H2O為還原劑的反應后處理較為麻煩，且產物胺在乙酸乙酯中的溶解度很小，后處理過程中產物損失很大。用水合肼還原時有副產物產生，可能是水合肼與原料中的甲酯基反應生成酰肼。

酰胺縮合反應是α-螺旋模擬物合成的關鍵步驟。常用的酰胺縮合反應的縮合劑有DCC/DMAP，EDCI/HOBT,HATU，PyBOP等，同時也可以使用酰氯法。本章中我們通過對多種縮合劑進行比較最終選擇了CMPI(向山試劑)作為縮合劑。向山試劑作為縮合劑反應條件溫和，操作簡單，價格便宜而且一般可以獲得較高的反應產率。

3　結　論

在本文中，我們以向山試劑作為縮合劑，通過酰胺縮合反應合成了苯環2-位取代的蛋白質α-螺旋模擬物。三聚α-螺旋模擬物的苯環2-位上連接的取代基，可通過形成五元環的分子內氫鍵維持分子構象的相對穩定和使得取代基具有相對穩定的空間取向。我們對這些合成的α-螺旋模擬物進行了氫譜、碳譜以及質譜的表征，對合成過程中需要注意的問題進行了討論，相信蛋白質α-螺旋模擬物會隨著研究者的不斷深入研究，將會挖掘出其獨特的生物化學性質而得到更廣泛的應用。

[1]Gavin A C, Bosche M, Krause R, et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes[J]. Nature, 2002, 415(6868): 141-147.

[2]Barnard A, Miles J A, Burslem G M, et al. Multivalent helix mimetics for PPI-inhibition[J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2015, 13(1): 258-264.

[3]Thompson S, Vallinayagam R, Adler M J, et al. Double-sided α-helix mimetics[J]. Tetrahedron, 2012, 68(23): 4501-4505.

[4]Jochim A L, Arora P S. Assessment of helical interfaces in protein-protein interactions[J]. Molecular BioSystems, 2009, 5(9): 924-926.

[5]Davis J M, Tsou L K, Hamilton A D. Synthetic non-peptide mimetics of α-helices[J]. Chemical Society Reviews, 2007, 36(2): 326-334.

[6]Cummings C G, Hamilton A D. Disrupting protein-protein interactions with non-peptidic, small molecule a-helix mimetics[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14(3): 341-346.

[7]Peczuh M W, Hamilton A D. Peptide and protein recognition by designed molecules[J]. Chemical Reviews, 2000, 100(7): 2479-2494.

[8]Rodriguez J M, Nevola L, Ross N T, et al. Synthetic inhibitors of extended helix-protein interactions based on a piphenyl 4,4′-dicarboxamide scaffold[J]. ChemBioChem, 2009, 10(5): 829-833.

[9]Clackson T, Ultsch M H, Wells J A. Structural and functional analysis of the 1:1 growth hormone: Receptor complex reveals the molecular basis for receptor affinity.[J]. Journal of Molecular Biology, 1998, 277(5): 1111-1128.

[10]Bullock B N, Jochim A L, Arora P S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design[J]. Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(36): 14220-14223.

[11]Reichmann D, Rahat O, Cohen M, et al. The molecular architecture of protein-protein binding sites[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2007, 17(1): 67-76.

[12]Block P, Weskamp N, Wolf A, et al. Strategies to search and design stabilizers of protein-protein interactions: A feasibility study[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2007, 68(1): 170-186.

[13]王慶蓮. 阿司匹林的應用及其不良反應[J]. 中國臨床醫生, 2000, 28(8): 34-35.

[14]肖新榮,劉傳湘,汪敏,等. 硫酸氫鈉催化合成阿司匹林的研究[J]. 精細化工中間體, 2002, 32(6): 42-43.

Synthesis of Protein α-helix Mimetics Based on Oligobenzamides

REN Yang, ZHOU Xiao-hu, ZHAO Si-qi, LIN Yu-lin, WANG Xiang, XU Hai

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Hunan Changsha 410083, China)

Design and synthesis of small molecule α-helix mimetics as an important and promising method to develop inhibitors of protein-protein interactions has received tremendous interest in recent years. This approach means simulating α-helix structure of the protein interaction interface hotspots using a series of small organic molecules. By the competitive binding of mimetics and protein complexes, scientist may screen out some α-helix mimetics which have the capable of blocking specific protein-protein interactions, and ultimately achieve the purpose of the corresponding disease treatment. The design and synthesis of 2-O-alkylated α-helix mimetics were studied based on oligobenzamides made aspirin as precusor.

oligoamides; α-helix; mimetics; aspirin

任揚(1992-)，男，研究生，研究方向為有機大分子化合物的合成。

徐海(1978-)，男，副教授，研究方向為有機光電功能材料的合成制備。

O625.5

A

1001-9677(2016)014-0088-03