藤茶中楊梅素高效轉化工藝研究

許江峰，李　慧，鐘世安

(中南大學化學化工學院，湖南　長沙　410083)

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藤茶中楊梅素高效轉化工藝研究

許江峰，李慧，鐘世安

(中南大學化學化工學院，湖南長沙410083)

本試驗以藤茶中提取的二氫楊梅素為原料，利用焦亞硫酸鈉脫氫氧化作用制得淡黃色成品，分離純化后對其進行了紅外光譜、核磁共振氫譜表征，確認產物為楊梅素。綜合單因素試驗結果，選取Na2S2O5與NaOH用量比例、反應液濃度、反應溫度為影響因素，楊梅素收率為響應值，對反應參數進行效應面分析優化。結果顯示，當Na2S2O5與NaOH用量比例為0.52，反應液濃度為36.68%，反應溫度為100.8 ℃時，楊梅素收率最高可達65.49%，純度高達96%，與預測收率65.65%的相對誤差僅為0.24%。

楊梅素；響應面優化法；焦亞硫酸鈉；半合成

楊梅素(3,5,7-三羥基-2-(3,4,5-三羥基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮)又稱楊梅酮、楊梅黃酮，屬黃酮醇類化合物。近年來研究發現，楊梅素在消炎鎮痛、降低血糖血脂、抑制糖尿病并發癥、治療心血管疾病、抗瘧以及抗腫瘤等多方面具有很好的藥理活性[1-6]。Ki等證實楊梅素對絲裂原活化蛋白激酶具有強烈的抗癌活性[7]。此外，楊梅素在調節誘導細胞凋亡方面的應用[8]也得到醫學者的廣泛關注。楊梅素作為一種具有顯著藥用價值的天然活性物質，分布于葡萄科、菊科等植物中，目前楊梅素的提取分離研究主要來源于藤茶[9]，而藤茶中楊梅素的含量只占2%[10]左右，趙全成在堿性環境下提取楊梅素的產率只有5%[11]，覃潔萍在提取過程中加入堿性轉化劑轉化二氫楊梅素得到楊梅素，收率最高也只有8%[12]，這極大程度上阻礙了楊梅素提取工藝的工業化生產。因此，全面而系統的研究藤茶中二氫楊梅素的提取純化進而實現楊梅素半合成的工藝優化方法具有很高的研究意義。

1　實　驗

1.1試劑及儀器

實驗所用試劑有：藤茶(食用級)，張家界家中林特產；乙醇(AR)，天津市大茂化學試劑廠；焦亞硫酸鈉(AR)，阿拉丁試劑；二氫楊梅素(AR)，阿拉丁試劑；楊梅素(AR)， 阿拉丁試劑；氫氧化鈉(AR)，安耐吉化學；鹽酸(AR)，安耐吉化學。

所用到的儀器設備有：RCT-Basic磁力加熱攪拌器，德國IKA實驗設備有限公司；FDF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長盛實驗設備有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津有限公司；FA1204B電子天平，上海精科天美化學儀器有限公司；DZF-6021真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SHA-C常溫水浴振蕩器，常州澳華儀器有限公司；KQ-50E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；800-1臺式電動離心機，北京中興偉業儀器有限公司。

1.2分析方法的建立

標準溶液的配置：分別準確稱取楊梅素與二氫楊梅素標準品12.5 mg、25.0 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL，得到濃度分別為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的標準溶液。

1.2.1最大吸收波長的確定

量取適量上述濃度的楊梅素與二氫楊梅素標準液，以甲醇溶劑為參比，于紫外分光光度計上進行全波長掃描，分別測定兩種溶液的最大吸收波長。

1.2.2標準曲線的繪制

色譜條件：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇:水:冰醋酸=50:50:1(V/V/V)；檢測波長：292 nm(二氫楊梅素)，375 nm(楊梅素)；檢測柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min。

分別吸取1.0 mg/mL 二氫楊梅素標準液0.05， 0.1， 0.3， 0.5， 1.0， 3.0， 5.0 mL和0.5 mg/mL 楊梅素標準液0.1， 0.2， 0.6， 1.0， 2.0， 6.0， 10 mL依次置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到系列濃度的對照品混合液，0.45 μm濾膜過濾，待用。在上述色譜條件下，分別進樣20 μL，測定峰面積，測3次取平均值。以樣品溶液濃度(C)為橫坐標，色譜峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得到二氫楊梅素和楊梅素的線性回歸方程。

1.2.3楊梅素收率的計算

楊梅素收率按如下公式計算：

(1)

1.3藤茶中楊梅素的轉化制備

1.3.1二氫楊梅素的提取

稱取20 g干燥的藤茶粉樣品，每次加蒸餾水300 mL于100 ℃油浴中浸提,分兩次進行浸提，然后趁熱過濾，合并兩次濾液，將濾液濃縮，1～5 ℃下冷卻析出淺黃色沉淀，過濾。將沉淀濾渣用一定量的無水乙醇溶解，靜置過濾除去不溶物后，將所得的乙醇溶液濃縮得到乙醇浸膏，于50 ℃干燥，稱重。

1.3.2楊梅素的轉化工藝

以二氫楊梅素為原料半合成楊梅素的反應路線如圖1所示。

圖1　楊梅素半合成路線

稱取干燥的藤茶粗提物 5 g于100 mL無水乙醇中進行重結晶，加熱攪拌超聲2.5 h后趁熱過濾，將濾液減壓濃縮得到乙醇浸膏，按一定的料液比加入NaOH與Na2S2O4的混合溶液于一定溫度下進行攪拌回流反應。反應結束后，調節pH至弱酸性，用冰塊進行快速冷卻，放置過夜，減壓過濾得到沉淀，50 ℃充分干燥，稱重，測定產品中楊梅素的含量，并計算楊梅素得率。

2　結果與討論

2.1最大吸收波長的確定

以甲醇為參比，在190～500 nm波長范圍內掃描，結果如圖2所示，二氫楊梅素與楊梅素的最大吸收波長分別為292 nm和375 nm。

圖2　二氫楊梅素和楊梅素的紫外吸收光譜圖

2.2標準曲線的繪制

分別在二氫楊梅素與楊梅素最大吸收波長下進行HPLC檢測，以樣品溶液濃度(C)為橫坐標，色譜峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，結果如圖3所示。計算可得二氫楊梅素和楊梅素的線性回歸方程分別為Y1=689525+1.95266X1(R2=0.9989，n=7)，線性范圍為0.005～0.5 mg/mL；Y2=-249278+5.23018X2(R2=0.99911，n=7)，線性范圍為0.005～0.5 mg/mL。

圖3　二氫楊梅素(A)和楊梅素(B)的標準曲線

2.3藤茶粗提物的定性定量分析

圖4為藤茶粗提取物與標準品的HPLC譜圖。

由HPLC譜圖可知，圖4B中保留時間在3.9 min附近的峰可歸為二氫楊梅素，根據楊梅素與二氫楊梅素的極性大小判斷，保留時間較長的8.5 min附近的小峰應歸屬為楊梅素的吸收峰。通過對提取物進行定量分析，粗提取物中二氫楊梅素含量為67.65%。

圖4　標準品(A)與提取物(B)的HPLC譜圖

2.4產物的結構鑒定

將反應制得的粗產物通過硅膠層析柱分離純化得到黃色產物，然后對其進行紅外光譜分析和核磁共振氫譜分析。

2.4.1FT-IR分析

對產物進行紅外光譜分析，結果如圖5所示。

圖5　產物的FT-IR圖

通過對產物的紅外光譜圖進行結構解析，可知波數3285 cm-1附近的吸收峰應為締合羥基的吸收峰，1665 cm-1處的吸收峰對應于C=O的共軛吸收峰。1597、1464、1518 cm-1處為苯環結構，1327、1026 cm-1處的吸收峰應歸屬于C-O-C的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動。結果顯示，該物質具有黃酮類物質的特異性官能團，且產物的紅外光譜圖與楊梅素標準品的紅外光譜圖峰型一致。

2.4.21H NMR氫譜分析

以氘代二甲基亞砜為溶劑對產物進行核磁共振氫譜表征，結果如圖6所示。

圖6　產物的1H NMR譜圖

對產物的1H NMR圖進行結構解析，結果如下(δ)：6.37(a)，6.18(b)，7.24(c、d)，9.37(e)，12.51(f)，9.24(g、i)，8.83(h)，10.80(j)。該圖譜數據與文獻報道的數據[13]一致，可知脫氫產物的結構與楊梅素結構相符。結合FT-IR分析結果可以推斷合成的化合物即為楊梅素。

2.5合成條件對楊梅素產率的影響

為了尋找楊梅素的最佳合成工藝，選取n(Na2S2O5)/n(NaOH)、反應液濃度、反應溫度、反應時間等4個可能影響楊梅素收率的合成條件進行單因素考察試驗。

2.5.1Na2S2O5與NaOH的用量比例

在半合成反應中，控制反應液濃度為35%，100 ℃下反應6 h，探索不同的n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例對楊梅素收率的影響，結果如表1所示。

表1　不同的Na2S2O5與NaOH用量比例下楊梅素收率情況Table 1　Myricetin yield of different ratio of Na2S2O5 and NaOH

結果表明，隨著Na2S2O5用量的增大，楊梅素收率逐漸增大，其中比例由0.20升高到0.60時楊梅素收率顯著提高。

2.5.2反應液濃度

控制n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.60，100 ℃下反應6 h通過改變反應液濃度來探究其對楊梅素收率的影響，結果如表2所示。

表2　不同反應液濃度下楊梅素收率情況Table 2　Myricetin yield of different reaction solution concentration

結果顯示，隨著反應液濃度的增大，楊梅素收率逐漸增大，其中反應液濃度由10%升高到35%的過程中楊梅素收率顯著提高。

2.5.3反應溫度的考察

控制n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.60，反應液濃度為35%，反應6 h，通過改變反應溫度探討其對楊梅素合成收率的影響，結果如表3所示。

表3　不同反應溫度下楊梅素收率情況Table 3　Myricetin yield of different reaction temperature

結果顯示，反應溫度由80 ℃上升到100 ℃的過程中楊梅素收率顯著增加，而100 ℃到120 ℃楊梅素收率顯著降低，說明當反應溫度在120 ℃附近時不利于該半合成反應的進行，有可能有副反應發生。

2.5.4反應時間的考察

控制n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.60，反應液濃度為35%，反應溫度100 ℃時，通過改變反應時間探究其對楊梅素合成收率的影響，結果如表4所示。

表4　不同反應時間楊梅素收率情況Table 4　Myricetin yield of different reaction time

結果顯示，當反應時間由4 h增加到6 h時楊梅素收率顯著提高而反應時間增加到8 h的過程中收率變化不大，可見反應在6 h左右已經基本完全。

2.6響應面法優化半合成工藝

根據單因素實驗情況綜合分析，選取n(Na2S2O5)/n(NaOH)、反應液濃度、反應溫度為影響因素，楊梅素收率為響應值，反應時間為6 h，采用響應面優化法對以上三個因素進行工藝優化設計。

2.6.1響應面實驗設計與結果處理

根據Design-Expert 8.0數據統計分析軟件設計實驗方案，通過實驗得到各組對應楊梅素收率如表5所示。

進一步對表數據進行回歸分析，得到回歸方程為：

Y=58.58+21.23A+5.62B+3.38C+3.40AB+3.51AC+2.52BC-21.76A2-6.79B2-6.16C2

(2)

式中，A為n(Na2S2O5)/n(NaOH)；B為反應液濃度；C為反應溫度；Y為楊梅素收率。

表5　響應面實驗法設計方案及結果Table 5　Experimental design and results of RSM

根據所得方程對數據進行回歸以及方差分析，結果如表6所示。

表6　回歸模型的方差分析Table 6　Results of regression analysis

從表6中可知回歸模型P<0.0001，具有很好的顯著水平，而失擬項P>0.05不顯著，說明所建立的回歸模型比較準確，擬合度較好，并且相關系數R2=0.9999說明實驗方案比較可靠，可以用于實驗數據分析與參數優化。

對實驗考察因素A、B、C和其兩兩交互項AB、AC、BC以及各因素二次方項A2、B2、C2進行分析，發現其P值均小于0.05，說明以上三種因素對楊梅素收率均存在顯著性影響，而且影響并不是呈現單一的線性關系，而是具有復雜而顯著的曲面效應。

2.6.2響應面圖與等高線圖分析

運用Design-Expert8.0軟件對模型數據制作響應曲面圖分析考察因素對楊梅素收率的影響情況，得到三因素兩兩交互項的三維響應曲面圖，如圖7所示。

圖7　響應曲面圖

根據三因素兩兩交互的曲面圖可以看出，響應曲面圖的最高點即對應為楊梅素收率的極大值。根據Design-Expert 8.0分析得，當n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.52，反應液濃度為36.68%，反應溫度為100.79 ℃時，楊梅素收率最大，為65.65%。

2.6.3實驗驗證分析結果

為了檢驗響應面優化的結果，取n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.52，反應液濃度為36.68%，反應溫度為100.8 ℃進行五組平行試驗，反應時間均為6 h測定楊梅素平均收率為65.49%，與預測結果65.65%相對誤差僅為0.24%，說明預測結果比較準確，該響應面分析優化方案比較可靠。

3　結　論

以藤茶中提取的二氫楊梅素為原料，通過在堿性環境下焦亞硫酸鈉脫氫反應半合成制得楊梅素，根據單因素試驗結果，選取n(Na2S2O5)/n(NaOH)用量比例、反應液濃度、反應溫度為影響因素，楊梅素收率為響應值，進行效應面分析優化。結果顯示當n(Na2S2O5)/n(NaOH)比例為0.52，反應液濃度為36.68%，反應溫度為100.79 ℃時，楊梅素收率最大，可達65.49%純度高達96%，與預測值65.65%的相對誤差僅為0.24%。

本試驗以天然物質藤茶為原料，提取得到的二氫楊梅素經純化后利用焦亞硫酸鈉脫氫氧化作用半合成制備楊梅素，大大提高了楊梅素的收率，不僅為藤茶深加工提供了新的發展方向，還為半合成楊梅素提供了新的參考方法。

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Highly Efficient Conversion Process Study of Myricetin in the Ampelopsis

XU Jiang-feng, LI Hui, ZHONG Shi-an

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Hunan Changsha 410083, China)

Myricetin was obtained through dehydrogenation of dihydromyricetin by the sodium metabisulfite. And the dihydromyricetin was extracted from the ampelopsis. The ehydrogenation products were characterized by FT-IR and1H NMR, which proved to be myricetin. Considering the results of the single factor experiment, the response surface process was conducted by selecting the proportion of Na2S2O5and NaOH, concentration of the solution, and reaction temperature as the impact factors and the yield of myricetin as the response value. The results showed that the yield of myricetin reached up to 65.49% and the purity of obtained myricetin exceeded 96% when the dosage ratio of Na2S2O5and NaOH was 0.52, the concentration of the solution was 36.68% and the temperature was 100.8 ℃. Compared with the predicted yield of 65.65%, the relative error was only 0.24%.

myricetin; response surface methodology; sodium metabisulfite; semisynthesis

許江峰(1991-)，女，碩士研究生在讀，制藥工程專業。

鐘世安(1972-)，男，教授，從事天然藥物化學研究。

TQ35

A

1001-9677(2016)014-0080-05