響應面法優化蛹蟲草子實體多糖的提取工藝研究*

黃　琰，朱賽君，杜羽亭，王伊帆，趙柯正興，孫詩清

(嘉興學院南湖學院，浙江　嘉興　314000)

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響應面法優化蛹蟲草子實體多糖的提取工藝研究*

黃琰，朱賽君，杜羽亭，王伊帆，趙柯正興，孫詩清

(嘉興學院南湖學院，浙江嘉興314000)

對蛹蟲草子實體多糖熱水浸提工藝進行研究。以人工培養的蛹蟲草子實體為原料，采用苯酚-硫酸法測定提取液中多糖的提取率為指標，考察提取溫度、提取時間、料液比對多糖提取率的影響，分別進行單因素試驗和響應面試驗優化。結果顯示，在單因素試驗篩選的水平區間，響應面優化的最佳提取工藝為：在78 ℃下，按照33 mL/g料液比，提取兩次，每次提取1.2 h，其多糖的提取率可達到6.11%，與模型的預測值接近。該工藝簡單可靠，為蟲草多糖的進一步產業化提供一定指導作用。

蛹蟲草；多糖；熱水浸提法；響應面試驗

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草[1]是屬于蟲草屬的一種名貴中藥材。在我國，蟲草菌的種類很多，但作為藥食兩用的只有兩種，一種叫做冬蟲夏草菌，一種叫做北冬蟲夏草菌。其中，大多質量標準以核苷類物質作為其質量控制指標之一[2-3],但其是不是主要的功能成分仍沒有定論[4]。蛹蟲草子實體多糖作為新興的活性物質群，已經在抗氧化[5-6]、抗腫瘤[7-8]、降壓[9]等方面表現出良好的生物活性。因此，本研究采用實驗室培養的蛹蟲草子實體作為原料，進行多糖物質群的提取工藝優化，為蟲草產品的進一步開發提供理論指導。

1　實　驗

1.1材料、試劑與儀器

蛹蟲草子實體粉末：蛹蟲草子實體來自嘉興學院生化學院生物試驗室培養，經75 ℃烘干后粉碎，再過100目篩，備用。標準葡萄糖溶液：精密稱取干燥的葡萄糖0.50 g稀釋定容置100 mL容量瓶中，充分搖勻，取出1 mL溶液于50 mL容量瓶中定容，制得100 μg/mL葡萄糖標準溶液，備用。乙醇，苯酚等均為分析純并購自阿拉丁。

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精密實驗設備有限公司；UV1801紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1單因素試驗

分別考察提取溫度、提取時間、提取次數和料液比對蟲草多糖的提取率的影響，其對應條件為：精確稱取干燥的1.0 g蛹蟲草子實體粉末，按30:1(體積:質量)的料液比，使用蒸餾水分別放在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的恒溫水浴中提取2次，每次提取1 h，將兩次的提取液過濾后合并，定容至100 mL容量瓶中；在提取時間的考察中，其他條件同上，在80 ℃的恒溫水浴中分別提取0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h；在提取次數的考察中，其他條件同上，分別提取1次、2次、3次、4次、5次、6次；料液比的考察中，其他條件同上，分別按10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g、50 mL/g、60 mL/g的料液比進行多糖的提取。按照1.2.3的測定方法進行不同提取條件下的多糖提取率計算，以提取條件對應多糖提取率作圖，分析其對多糖提取率的影響。

1.2.2響應面試驗設計

在上述單因素試驗中，選取提取溫度、提取時間和料液比這三個對多糖提取率影響較大的因素，利用 Design Expert 軟件，根據 Box-Behnken 試驗設計，代表符號分別為X1、X2、X3，并以-1、0、1分別代表這三個自變量的各個水平(見表1)，通過最小二乘法來擬合出二次多項式方程，方程如下：

其中，Y是響應值(多糖提取率)；Xi、Xj(i≠j)代表自變量；A0、Ai、Aii、Aij為系數。

表1　因素-水平設計表Table 1　Factors-Level Design

1.2.3標準曲線的繪制與多糖提取率的計算

本試驗采用硫酸-苯酚法測量多糖[10]的含量。以葡萄糖作為標準品，以葡萄糖濃度(μg/mL)為X軸，以吸光度A為Y軸，繪制標準曲線，結果葡萄糖濃度在0～70 μg/mL時得回歸方程：y=0.0076x-0.0135，其中R2=0.985。

多糖的提取率按以下公式計算：

式中：C——樣液中多糖濃度，μg/mL

m——蛹蟲草子實體粉末質量，g

V1——定容體積，mL

V2——樣液稀釋倍數

2　結果與討論

2.1單因素試驗結果

圖1　單因素對多糖提取率的影響

由圖1A可見，在40～80 ℃之間，多糖的提取率隨溫度的升高而有明顯的增大，在80 ℃時達到最高點，為5.77%，超過80 ℃之后隨著溫度的進一步升高，多糖提取率反而有所降低，故選擇提取溫度80 ℃為好。由圖1B可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率也隨之增加，在提取時間為1 h時達到最高，為6.19%，而后趨于平行，甚至有些降低，故選擇提取時間1 h為好。從圖1C可知，蟲草多糖提取率隨提取次數的增加而增加，在前兩次提取操作中，其增加幅度較大，而隨后，當提取次數繼續增加時，多糖提取率不再有大幅度的變化，而是趨于平行，故選擇提取2次為宜。由圖1D的結果顯示，當料液比在10～30 mL/g時，可以十分明顯的看出蟲草多糖的提取率隨著溶劑體積的增加而增加，在料液比為30 mL/g時提取率達到最高，為6.09%，而當蒸餾水體積繼續增加時，多糖提取率基本趨于平行，因此在料液比為30 mL/g時，蟲草多糖基本達到了最大溶出量。

2.2響應面試驗結果

2.2.1模型的建立與顯著性檢驗

表2　Box-Behnken實驗設計及測定結果Table 2　Box-Behnken experimental design and measurement results

通過2.1的結果分析，固定提取次數為兩次，選擇提取時間1 h、提取溫度80 ℃、料液比30 mL/g為中心點，進行Box-Behnken試驗設計，結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程如下：

表3　回歸模型方差分析及模型系數Table 3　Variance analysis and model coefficient

注：“*”表示顯著(P<0.05)； “**”表示極顯著(P<0.001)。

2.2.2模型的驗證優化

利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸方程進行分析，得到熱水浸提法提取蛹蟲草多糖的最優提取工藝為：提取溫度為77.87 ℃、料液比為33.65 mL/g、提取時間為1.2 h，其預測多糖提取率為6.17%。根據實際情況，選擇提取的工藝條件為：提取溫度80 ℃、料液比33 mL/g、提取時間1.2 h。在該條件下進行3次平行試驗取平均，實際測得的蛹蟲草多糖提取率為6.11%，與方程預測值的誤差為0.972%，在誤差允許范圍內(5%)，說明該方程能很好的反映各因素對蛹蟲草多糖提取率的影響情況。

3　結　論

(1)在單因素的實驗結果中，發現提取次數在兩次以后基本穩定，沒有大幅度變化，同時第一次與第二次的變化也沒有其他三個因素明顯，因此在響應面實驗中固定提取次數為兩次，選擇提取時間、提取溫度和料液比為考察因素；在其他的三個單因素實驗結果中，顯示提取時間和提取溫度對提取率并不是越大越好，當達到一定的數值(如時間1 h，溫度80 ℃)時，多糖的提取率最高，然而對于料液比是達到一定數值后，基本趨于平穩，考慮后期的濃縮和純化成本，選擇30 mL/g為響應面試驗的中心點。

(2)在單因素實驗結果的基礎上，通過響應面試驗對蛹蟲草多糖的提取工藝進行了進一步優化，對試驗結果進行方程模擬和預測，探討了提取溫度、料液比和提取時間這三個因素中兩兩因素之間的交互作用對蛹蟲草多糖提取率的影響，得出用熱水浸提法提取蛹蟲草多糖的最佳工藝條件為：蛹蟲草子實體粉末過100目藥篩，按照33 mL/g的料液比，在80 ℃下提取2次，每次1.2 h，蛹蟲草多糖提取率達到6.11%，與響應面模型的預測值基本一致，說明此優化模型可靠，有實用價值。

[1]邵力平.真菌分類學[M].北京:中國林業出版社,1984:109.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學工業出版社,2005:75-76.

[3]劉玉軍,徐芳,陳波,等.毛細管區帶電泳法測定冬蟲夏草及人工北冬蟲夏草子實體中核苷及堿基成分的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(1):24-29.

[4]Li S P, Yang F Q, Tsim K W K. Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2006,41(5):1571-1584.

[5]Wang M, Meng X Y, Yang R L, et al. Cordyceps militaris polysaccharides can enhance the immunity and antioxidation activity in immunosuppressed mice[J]. Carbohydrate polymers, 2012, 89(2): 461-466.

[6]Wu F, Yan H, Ma X, et al. Comparison of the structural characterization and biological activity of acidic polysaccharides from Cordyceps militaris cultured with different media[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28:2029-2038.

[7]ZHANG Guo-qing, HUANG Yue-dong, BIAN Yong,et al. Hypoglycemic activity of the fungi Cordyceps militaris,Cordyceps sinensis, Tricholoma mongolicum and Omphalia lapidescens in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(6): 1152-1156.

[8]YANG Jin-yu, ZHANG Wei-yun, SHI Pei-hua, et al. Effects of exopolysaccharide fraction (EPSF) from a cultivated Cordyceps sinensis fungus on c-Myc, c-Fos, and VEGF expression in B16 melanoma-bearing mice [J]. Pathology Research and Practice,2005,201(11):745-750.

[9]Hu Z, Xia F B, Wu X G, et al. Cordyceps sinensis new efficacy composition [J]. Edible Fungi of China,2004,23(5):37-38.

[10]魯曉巖.硫酸-苯酚法測定北冬蟲夏草多糖含量[J].食品工業科技,2002,23(4):69-70.

Research on Extraction of Polysaccharides from Cordyceps militaris by Response Surface Method*

HUANG Yan, ZHU Sai-jun, DU Yu-ting, WANG Yi-fan, ZHAO Ke-zheng-xing, SUN Shi-qing

(Nanhu College, Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314000, China)

The extraction process of polysaccharide was studied in the paper by hot water assisted extraction fromCordycepsmilitaris. The content of polysaccharides was determined by phenol-vitriol method. The effects of extraction temperature, extraction time, solid-liquid ratio and the number of extraction were investigated on the basis of single factor test. Through response surface methodology, the optimum extraction conditions of polysaccharide were as follows: solid-liquid ratio of 33 mL/g, extraction time of 1.2 h, extraction temperature of 80 ℃, two time extraction under this process condition, the extraction rate of polysaccharides was 6.11%. The optimized extraction method was simple and guided large-scale extraction of polysaccharides fromCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; polysaccharide; hot water infusion extraction; response surface methodology

2015年嘉興學院大學生研究訓練(SRT)計劃項目(NH8517150)。

黃琰(1994-)，女，嘉興學院南湖學院生物工程專業在校本科生。

O62

A

1001-9677(2016)014-0073-04