病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黃金林

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病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黃金林

隨著高通量測序技術和蛋白組學技術的發展，越來越多的病原菌新基因被發現，研究病原菌新基因有助于更好的防控由該病原菌引起的疾病的傳播。本文從生物信息學角度、新基因功能獲得與缺失、與新基因編碼產物互作蛋白的分析等方面綜述了適用于病原菌新基因功能研究的策略，為基因分子生物學等相關領域提供參考。此外，本文還結合常規的新基因研究方法，將芯片技術，2D-DIGE技術滲透入病原菌新基因研究策略中，使研究者能更快捷準確的找出新基因功能研究的切入點，進而制定切實可行的新基因功能的研究方案。

病原菌新基因；生物信息學；基因功能；蛋白質相互作用

隨著全基因組測序技術的快速發展，利用轉座插入突變體偶聯測序技術從病原微生物基因組中篩選新基因越來越準確快捷，但闡明新基因編碼蛋白的生物學特性、生物學功能、與臨床醫學之間的關系、新基因表達調節機制還十分困難，病原菌新基因功能研究仍然是分子生物學研究領域中具有挑戰性的工作。通常對于新基因功能的研究，首先是利用數據庫中已有的信息對新基因進行生物信息學分析；其次應用分子生物學技術對該基因進行體內或體外分析，并通過體內篩選與該基因編碼蛋白相互作用的蛋白進一步確證該基因在病原菌致病過程中發揮的作用。

1　新基因生物信息學分析

生物信息學(Bioinformatics)是隨著生命科學和計算機科學的迅猛發展，由生命科學和計算機科學相結合形成的一門新學科。目前，各類病原微生物基因及蛋白信息數據庫已更新的相對完備，生物信息學分析也成為新基因功能研究的首選方法[1]。利用數據庫中已有的信息可快速了解與新基因功能有關的信息，初步推測新基因可能的功能，據此制定進一步的研究方案。

1.1新基因序列分析生物信息學的核心是基因組信息學，即以基因組DNA序列的信息分析為基礎尋找發現新基因[2]。新基因序列分析包括堿基序列基本參數分析以及序列同源性比對。序列基本參數統計包括分子質量、GC百分含量、融合溫度(Tm值)、摩爾消光系數等核酸序列基本指標的計算[3]。可通過一些常用軟件如JaMBW軟件包中的工具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等進行綜合計算(http://www.bioinformatics.org/JaMBW/)。隨后進行新基因序列同源性分析，包括基因序列同源性和氨基酸序列同源性分析，如應用NCBI數據庫中BLAST程序進行基因序列比對，應用Uniprot數據庫中的BLAST程序進行蛋白序列比對(http://www.uniprot.org/)等。通過比對發現與新基因或氨基酸序列高度同源的基因或蛋白，通過這些已知基因或蛋白的信息推測未知基因的功能。Gao等[4]于2014年應用轉座突變體偶聯二代測序技術發現變形菌屬彎曲菌基因組中的一些變形菌屬特異新基因，通過序列與結構同源性分析初步推知所篩選的新基因的功能。

1.2新基因編碼產物的分析首先可以對新基因編碼產物進行理化性質分析，其次運用swiss-model預測蛋白結構，并進行結構同源性分析，通過比對后獲得結構同源性較高的已知蛋白，可以推測未知基因蛋白的功能。此外預測病原菌新基因編碼產物的結構域，功能域對于制定后續蛋白功能研究策略具有至關重要的意義。如預測該蛋白是否有信號肽(SignalP4.0)、跨膜結構(TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)以及脂蛋白信號肽等可以推測該蛋白是否為膜蛋白或分泌性蛋白。 Marchant等[5]綜述了多個空腸彎曲菌Tlp蛋白預測受體和跨膜信號肽結構域，使我們更好的了解空腸彎曲菌的趨化機制。

2　新基因功能獲得與失活

了解病原菌新基因功能最直觀的方法就是對該基因體內過表達或失活。通過觀察病原菌表型變化或者生理生化特性的改變分析該基因可能的功能。

2.1新基因功能獲得方法在新基因上游加入可調控原件并通過載體轉入某一特定的細胞中(也可以是新基因突變株)，使其過表達，觀察該細胞生物學特性以及生理生化反應，代謝等方面的變化，從而了解該基因的功能，如果是轉入細胞中稱為轉染，基因轉染運載系統分為非病毒方法和病毒方法。非病毒方法又分為化學轉染法，生物轉染法及物理轉染法。另一種轉染運載系統是病毒作為載體，其優勢有能夠在轉化細胞中將目的基因穩定遺傳，其次能夠將克隆的基因作為病毒染色體的一部分，并且能夠進行分離，最重要的是轉化效率高[6]。Marijke Keestra等[7]將鼠傷寒沙門菌sipA基因構建到真核表達質粒并轉染HEK293細胞，發現該基因編碼毒力因子能夠激活NOD1/NOD2信號通路。轉化是構建新基因過表達株最常用的方法，應用誘導型高效表達質粒將新基因轉入該基因的突變株。轉化方法有電轉化和熱激法。

2.2新基因功能失活方法觀察病原菌在新基因功能被部分或者全部失活后，生物學行為或表型變化來鑒定新基因的功能。為使基因功能失活可以使該基因敲除、突變或者缺失，也可以從轉錄水平進行干擾蛋白的合成但該類方法極少用于病原菌的研究。基因水平的失活方法有基因敲除技術(主要用于動物模型的建立)、基因缺失技術和基因突變技術。80年代初，胚胎干細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎，運用基因同源重組進行基因敲除是構建基因敲除動物模型最普遍使用的方法[8-9]。Robert等[10]于2007年建立了myd88基因敲除小鼠模型，發現nramp1基因在彎曲菌感染中發揮作用。病原菌最常用的基因功能缺失方法就是使該基因突變。Red同源重組系統是常用的構建病原菌突變株的方法，運用高效自殺載體系統同樣能達到基因突變的目的。前者相對后者操作簡單，但在某些病原菌中還沒有應用[11-12]。Kao等將csrA與rpoN基因突變后幽門羅桿菌J99運動力及粘附能力均顯著下降，說明csrA，rpoN影響幽門桿菌J99鞭毛發揮正常作用[13]。 Malik Tareen 等[14]將空腸彎曲菌cj0268c基因突變后，粘附侵襲Caco-2細胞的能力均有下降，說明該基因與彎曲菌粘附侵襲能力有關。

轉錄水平的基因沉默即干擾mRNA翻譯成蛋白質這一過程。此類技術常用于真核生物及病毒的研究。原核生物由于轉錄和翻譯幾乎同時進行，所以干擾mRNA的翻譯有一定的局限性。目前最為常用的基因沉默技術是RNAi技術，該技術利用與靶mRNA具有同源性microRNA與阿爾法古蛋白家族形成RNA沉默復合體，特異性結合并降解靶mRNA[15]。大量研究表明RNAi技術在醫學研究中用于治療多種疾病大有前景[16-18]。如 Peer等[19]利用β7-targeted siRNA 治療小鼠腸炎，β7-targeted siRNA的靶分子是編碼細胞周期素(CyD1)的mRNA，能夠特異性的與之結合并降解，從而使腸道上皮細胞炎性有一定的恢復。

3　病原體基因表達水平的檢測

病原菌新基因功能失活或過表達后，若能得知某些已知基因上調或下調表達，那么該基因與上調或下調表達的已知基因的功能定存在直接或間接關系。

3.1mRNA表達水平的變化檢測mRNA表達量的傳統技術有實時定量RT-PCR技術及Northern Blot，二者皆能夠定量檢測mRNA的轉錄水平變化，但也各有不足，實時定量RT-PR成本較高，而Northern Blot操作較為繁瑣，且使用放射性元素標記，會產生放射性污染。因此在實際研究中，研究者需根據實驗需求而選擇，二種實驗技術互相補充有時是必要的。

基因芯片是當下較為熱門的一項技術。其原理是采用光導原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經過相應處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然后加入標記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息[20-21]。基因芯片是分析新基因功能的優良工具[22]。Gong等[23]使用基因芯片技術等發現malS 5′-UTR(ncRNA)可調控bax基因的表達，因此malS 5′-UTR(ncRNA)影響鼠傷寒沙門菌的侵襲能力。RNA-Seq技術是近年來新興的高通量表達譜分析技術，盡管目前為止該技術發展并沒有成熟，但具有很好的應用前景[24]。Butcher等[25]應用RNA-seq技術分析了空腸彎曲菌編碼鐵激活蛋cjfur，cjperR基因缺失株的轉錄組變化，發現在鐵離子缺少的情況下，鐵依賴基因差異表達。

3.2蛋白表達水平的變化蛋白芯片技術繼基因芯片技術之后又一新型技術。它的基本原理是將各種蛋白質有序地固定于載玻片等各種介質載體上成為檢測的芯片，然后，用標記有特定熒光物質的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質結合，抗體上的熒光將指示對應的蛋白質及其表達量[26]。2D-DIGE技術也是用于研究蛋白組學的一項有力技術[27]。首先將樣品分別用不同的熒光標記(如Cy2，Cy3)，并將2種樣品等量混合，同時在一塊膠上進行電泳，然后將跑好的2D圖像用激光經不同的濾光器后進行熒光信號分析，根據熒光信號的比例定量分析上調表達與下調表達的蛋白[28]。Condell 等[29]應用2D-DIGE技術分析沙門菌耐受三氯生抗菌劑的蛋白組學，結合質譜鑒定技術，對野生株ST23與突變株ST23M比較蛋白組學分析發現有18個上調表達蛋白，9個下調表達蛋白，這說明2D-DIGE技術可以用來分析新基因缺失后與野生型蛋白表達差異。

4　新基因編碼產物與已知蛋白相互作用研究策略

蛋白-蛋白之間的相互作用貫穿于細胞生命活動的每個過程，包括DNA的復制、轉錄、翻譯、拼接以及分泌，多數蛋白質以復合體的形式存在。研究蛋白之間的相互作用是闡明蛋白作用機制和生物學功能的基礎。

4.1體外GST pull-down技術谷胱甘肽S轉移酶pull-down(glutathione S-transferase pull-down，GST pull-down)技術利用GST對谷胱甘肽的親和作用，從蛋白混合液中分離出相互作用蛋白，是進行體外研究蛋白相互作用的有效方法[30]。

目前，GST pull-down已廣泛應用于蛋白互作研究領域，該技術可聯合質譜法篩選與已知蛋白相互作用的靶蛋白，也可以對已知的相互作用蛋白進行驗證。黃勇等[31]用GST pull-down技術驗證大腸桿菌YggG與Era蛋白之間存在相互作用，說明該基因的表達與大腸桿菌的環境應激相關，提示yggG基因產物參與細菌的應激調控。2010年，Kanno等[32]表達GST-Rab1-43蛋白，運用GST pull-down聯合質譜法篩選出哺乳動物單體GTP酶的效應因子。Minamino 實驗室[33-35]先后3次使用GST pull-down 技術證明 FliI ATPase 和鞭毛伴侶蛋白FliT 在沙門菌SJW1368鞭毛蛋白輸出過程中具有相互作用，鞭毛伴侶蛋白FlgN分別與FlgK，FlgL鞭毛蛋白C端結合以防止二者在運輸過程中被水解以及鞭毛伴侶蛋白FlgN和FliT的C端殘基分別與FlhAC相互作用，證實FlhA在鞭毛絲合成過程中發揮一定作用。該方法不足之處在于缺乏體內生理條件，且不能檢測到蛋白間的瞬時作用。另外，該技術需要足量的活性蛋白，因此具有一定的局限性；GST標簽也可能會影響蛋白的空間結構，從而造成假陰性結果。

4.2胞內免疫共沉淀技術另一種檢測蛋白相互作用常用的方法是免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎來研究蛋白質相互作用的經典方法，也是確定2種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法[36]。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質與蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。Lung 等[37]應用Co-IP技術證實大腸桿菌中其他與T3SS毒力蛋白NleB1相互作用的蛋白，豐富了該蛋白的毒力功能。黃琪等[38]利用免疫共沉淀聯合質譜分析，在卡介苗(BCG)中篩選與PPE蛋白家族Rv3425相互作用的蛋白，發現Rv3425與Rv3614c相互作用，推測Rv3425可能與ESX-1蛋白分泌系統及結核分枝桿菌致病機制密切相關。該技術與普通的ELISA和Western-blot技術相比，使用的抗體需達到一定的濃度并對相應抗原有較高的親和力，否則會出現假陽性現象。另外針對誘餌蛋白的特異性抗體可能與相互作用蛋白競爭性結合，從而影響相互作用蛋白復合物的穩定性[39-40]。

5　展　望

筆者相信隨著生物技術的不斷發展，未來高通量大規模測序技術會普及于生物學領域，因此將會有更多的病原菌新基因被挖掘。另外，基因及蛋白數據庫不斷完善，這對后續新基因研究提供更多的依據。研究病原菌的新基因能夠更深的了解該病原菌的特性，與臨床醫學的關系，以及致病機制，對于因該病原菌引起的疾病的防控具有重要意義。本文雖然主要綜述病原菌新基因功能的研究策略，但許多技術也適于其他生物的新基因功能的研究，希望本文能為從事本行業工作的研究者們提供借鑒。

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Strategy for pathogen novel gene function research

DU Xue-qing, HUANG Jin-lin

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

With the development of high-throughput sequencing technology and proteomics technology, more and more pathogen novel genes were discovered. To explore novel genes of pathogen is helpful to prevent and control the diseases caused by these pathogen better. In the perspective of bioinformatics, acquisition and deletion of novel gene, analysing novel gene encoding product, this article reviews strategies that are suitable for the research of pathogenic bacteria novel gene, which provides a reference for genetic and molecular biology. Combined with conventional methods, this article penetrates chip technology, 2D-DIGE technology into the pathogen novel gene research strategy. It enables researchers to find a new breakthrough of gene function research and further formulate feasible research plan of novel gene function.

pathogen novel gene; bioinformatics; gene function; protein interaction

Supported by the National Natural Science Foundation of China Grant (No.31372449) and the National Key Technology R&D Program (No. 2014BAD13B02)

Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn

黃金林，Email：jinlin@yzu.edu.cn

揚州大學，江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州225009

R378

A

1002-2694(2016)07-0665-05

2015-11-26；

2016-04-24

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.015

國家自然科學基金(No.31372449)、國家支撐計劃(2014BAD13B02)