2015年春季無錫地區兒童肺炎支原體及呼吸道常見致病菌的分析

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2015年春季無錫地區兒童肺炎支原體及呼吸道常見致病菌的分析

常青1，閆超2，俞蓉1，高燕敏1，歐陽冰1，孫紅妹2

目的了解無錫地區下呼吸道感染住院患兒肺炎支原體耐藥情況及呼吸道常見致病菌的分布，為預防和治療提供依據。方法采用PCR法檢測患兒咽拭子中的肺炎支原體及其耐藥基因，采用real-time PCR法檢測其他呼吸道常見致病菌。結果共檢測標本288例，檢出病原菌59例，陽性檢測率為20.5%。細菌檢出率隨年齡增長有下降趨勢，<2歲兒童陽性檢出率最高，且女性高于男性。病原菌構成比分別為：肺炎支原體28.8%(17/59)，KP為30.5%(18/59)，SA為20.3%(12/59)，PA為20.3%(12/59)，SE為15.3%(9/59)，HI為10.2%(6/59)，SP為5.08%(3/59)，LP為5.08%(3/59)，EC，CP，TB均為0例(0%)。其中肺炎支原體大環內酯類耐藥率為88.2%，10例存在合并感染。結論無錫地區住院患兒下呼吸道感染的病原菌以肺炎支原體和肺炎克雷伯桿菌為主，且大環內酯類耐藥率較高。

肺炎支原體；耐藥；呼吸道常見病原菌；兒童；無錫

Supported by the Wuxi Municipal Commission of Health and Family Planning (Woman and Child Health Scientific Research Project)

呼吸道感染是兒童最常見的疾病，可引起兒童急性支氣管炎、肺炎，嚴重者可引起呼吸衰竭和心力衰竭，對患兒的危害較大。據聯合國兒童基金會統計，全世界每年約有350萬左右5歲兒童死于肺炎；我國每年<5歲兒童因肺炎死亡者約35萬人[1]。其中，肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae, MP)是引起兒童呼吸道感染的重要致病菌之一，臨床癥狀可從輕微的咽炎、支氣管炎到重癥肺炎，嚴重感染可導致死亡[2]。MP引起的肺炎，占社區獲得性肺炎的20%左右，流行高峰年其感染率可達30%以上[3]。此外，兒童呼吸道常見病原菌主要包括肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，KP)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae，HI)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli，EC)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)、結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，TB)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，CP)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila，LP)等[4]。此前，關于無錫地區呼吸道感染的相關報道較多，但關于肺炎支原體與呼吸道感染及其他常見致病菌關系以及肺炎支原體耐藥分析方面的報道較少。

本研究收集下呼吸道感染住院患兒標本，進行肺炎支原體及其他呼吸道常見致病菌檢測，了解呼吸道感染中肺炎支原體與其他常見病原菌的構成關系，以及肺炎支原體耐藥情況，對無錫地區2015年春季兒童呼吸道感染現狀進行分析。

1　材料和方法

1.1研究對象與標本采集2015年2-5月，無錫市第八人民醫院兒科住院下呼吸道感染的患兒標本288例，來自無錫市各區，下呼吸道感染診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》第7版，排除標準：支氣管肺發育不良，先天性心臟病，免疫缺陷病等。標本類型為咽拭子(用無菌咽拭子，在被檢測患兒咽后壁采集分泌物)。其中，2015年2月127例(44.1%)，3月35例(12.2%)，4月55例(19.1%)，5月71例(24.7%)；男166例(57.6%)，女122例(42.4%)；年齡為7月～13歲，平均年齡為3歲9月。其中<1歲28例(9.72%)，1～2歲82例(28.5%)，3～6歲144例(50.0%)，7～13歲34例(11.8%)。

1.2研究方法

1.2.1標本DNA提取采用Qiagen 的QIAamp DNA提取試劑盒對上述呼吸道標本進行DNA提取，操作步驟嚴格按照說明書進行。DNA提取后保存于-20 ℃用于呼吸道常見病原菌檢測。

1.2.2肺炎支原體檢測采用首都兒科研究所細菌研究室設計的引物[5]，針對肺炎支原體的基因組中的串聯重復序列區域Mpn14進行擴增，片段長度為243 bp。25 μL PCR反應體系中包含2× Taq PCR MasterMix (天根生化科技北京有限公司)12.5 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物濃度均為0.4 μmol/L。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min擴增35個循環, 72 ℃再延伸 10 min。在Veriti 96-well 熱擴增儀(Applied Biosystems，美國)上進行擴增。PCR產物通過瓊脂糖凝膠觀察結果。陽性擴增產物由invitrogen 英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，并利用Basic Local Alignment Search Tool analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。

1.2.3肺炎支原體耐藥基因檢測采用李少麗等文獻中報道的nPCR-SSCP-CE法，結合套式PCR、單鏈構象多態性分析(SSCP)和毛細管電泳(CE)的方法，分析Mp 23S rRNAV區中常見的耐藥基因突變位點2063和2064[6]。存在突變的擴增產物由invitrogen 英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，并將測序結果利用Blast進行比對，進一步驗證常見耐藥突變位點是否發生突變。

1.2.4其他呼吸道常見致病菌檢測參照首都兒科研究所細菌研究室設計的引物，擴增Sp，Kp，Sa，Se及Hi[7]，此外利用primer5.0軟件設計特異性引物擴增Cp，Lp，Tb，Pa，Ec。用DNA分析軟件(http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp)評價引物之間有無二聚體及環狀結構，同時在NCBI數據庫中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行Blast比對，檢測引物特異性。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列及擴增片度長度見表1。采用real-time PCR(SYBR Green I)法，擴增目的片段。20 μL PCR反應體系中包含2× SuperReal PreMix Plus with SYBR Green I(天根生化科技北京有限公司)10 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物濃度均為0.25 μmol/L。PCR反應條件為：95 ℃預變性8 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，擴增35個循環。

1.2.5統計學方法應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，分析過程中應用了卡方檢驗，兩兩比較過程中采用配對設計四格表卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1肺炎支原體檢測結果288例下呼吸道感染標本中，17例為肺炎支原體陽性，陽性率為5.90%。其中2月7例，3月4例，4月5例，5月1例，陽性率分別為5.51%，11.4%，9.09%和1.41%。其中男性中檢測出MP陽性6份，女性中檢測出MP陽性11份。MP陽性標本在不同年齡組的分布為，<1歲為2例，1～2歲為3例，3～6歲為9例，7～13歲為3例，各年齡組的陽性率分布為7.14%，3.66%，6.25%和8.82%。采集時間，患兒性別及年齡的差異均無統計學意義。

表15種呼吸道常見致病菌檢測引物

Tab.1The primer sequences used for the bacteria detection

PrimersGeneSequence(5'-3')Length(bp)CP16SrRNACP-F1346TCCCCTTCTTTAATATATATTAG1368139CP-R1486TGACTTCGGTTGTTATTTAGTGGCG1460LP16SrRNALP-F808TTGGTTATATGAAAATAATTA82895LP-R902CCGTCAATTCATTTGAGTTT883TB16SrRNATB-F672GGTGTAGCGGTGGAATGCGC691140TB-R811CACCGTTTACGGCGTGGAC793PA16SrRNAPA-F1381GGGCCTTGTACACACCG1397128PA-R1508ACGGTTACCTTGTTACGACTT1488EC16SrRNAEC-F49TAACACATGCAAGTCG6471EC-R119TTACTCACCCGTCCGCC103

2.2肺炎支原體耐藥基因檢測結果17例肺炎支原體陽性標本中，15例存在大環內酯類耐藥基因突變，突變率為88.2%，其中14例為A2063G突變，1例為A2063T的突變。

2.3呼吸道常見致病菌檢測結果除MP外，288例標本中54例(18.8%)可檢測出其它呼吸道常見致病菌，構成比分別為：KP為30.5%(18/59)，SA為20.3%(12/59)，PA為20.3%(12/59)，SE為15.3%(9/59)，HI為10.2%(6/59)，SP為5.08%(3/59)，LP為5.08%(3/59)，EC，CP，TB均為0例(0%)， KP，SA以及PA感染占主要地位。2月18例，3月18例，4月12例，5月6例，陽性率分別為14.2%，51.4%，21.8%和8.45%。各月份細菌感染比較，差異有統計學意義(χ2=31.5，P<0.05)，3月份明顯高于其他月份。存在細菌感染的男性為18例，女性為36例，陽性率分別為10.8%和29.5%，差異有統計學意義(χ2=16.1，P<0.05)，女性高于男性。細菌感染在不同年齡組的分布為，<1歲為12例，1～2歲為15例，3～6歲為24例，7～13歲為3例，各年齡組的陽性率分布為42.6%，18.3%，16.7%和8.82%，差異有統計學意義(χ2=13.3，P<0.05)，其中<1歲組高于其他年齡組。54例細菌感染標本中，6例(11.1%)存在合并感染，其中KP+PA為3例，SA+HI+PA為3例。與MP感染綜合分析可知，肺炎支原體與細菌感染標本共59例，陽性率為20.5%。其中，10例(10/59，16.9%)存在合并感染的標本中，除SA+HI+PA及KP+PA(均為3例)外，MP+KP為2例，MP+HI為1例，MP+PA為1例。2月3例，3月1例，4月2例，5月4例；男性中檢測出2例，女性中檢測出8例；在不同年齡組的分布為，<1歲為4例，1～2歲為0例，3～6歲為3例，7～13歲為3例，差異均無統計學意義(所有P值均>0.05)。

表2288例標本合并感染情況

Tab.2Co-infection in the 288 specimens

Co-infectionTypesNumberTwoKP+PA3Mp+KP2Mp+HI1Mp+PA1ThreeSA+HI+PA3

3　討　論

肺炎支原體是社區獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，尤其是學齡前兒童和青壯年。兒童肺炎中10%～30%的病例是MP引起的，一年四季均有出現，但以冬春季發病為主。主要通過與患者的近距離接觸傳播，從接觸密切的親屬和社區開始流行，每3～7年在不同地區出現MP流行高峰，在流行高峰年MP肺炎可高達30%～50%[2-3]。對家庭、學校、部隊、社會都會產生較大的經濟損失和社會不良影響，應該引起人們足夠的重視。研究資料顯示，無錫地區肺炎支原體感染率2004-2005年為27.0%[8]，2007年為27.11%，MP的感染率相對較高[9]。本研究中，MP的陽性檢測率為5.90%，低于項紅霞等報道的無錫地區2008-2010年感染率[10]。我們之前的研究顯示[11]，2007年和2012年為MP的暴發流行年，而2015年2-5月為非流行期，因此，MP感染率相對較低。

2000年以來，世界各地均陸續出現了肺炎支原體耐藥的相關報道。大環內酯類耐藥基因檢出率不斷攀升，歐洲國家的耐藥率較低，小于10%[12]，美國也低于10%[13]，而日本耐藥率大于80%[14]，在中國耐藥率最高，達到了90%以上[15]，但關于無錫地區肺炎支原體臨床菌株耐藥性報道較少。本研究中，肺炎支原體大環內酯類耐藥基因突變率為88.2%，與北京，上海等地區的報道一致[15-16]，遠遠高于歐美國家[12-13]，在肺炎支原體治療用藥方面應該引起足夠重視。

病毒是上呼吸道感染的主要病原，細菌是下呼吸道感染的主要病原，細菌感染率可高達55%。病原菌的分布特點與時間和地域差異關系密切，了解細菌分布，對于臨床診斷和治療均有重要意義，可避免抗生素的濫用和耐藥菌株的產生。目前，病原菌分離培養法為病原學診斷的金標準，也是目前臨床最常用的診斷方法，但分離培養耗時長，受標本采集、運輸和培養條件的影響較大，且有些需特殊培養的常見細菌如SP、HI 的檢出率不高。

本研究中，下呼吸道感染患兒按年齡組分析，學齡前兒童(3～6歲)占比例最高(144例，50%)，其次為幼兒(38.2%)和學齡兒童(11.8%)，與2014年張昕婷等的結果一致[17]。

無錫地區下呼吸道感染病原菌中肺炎克雷伯桿菌最常見，其次為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，未檢測出大腸埃希菌，肺炎衣原體及結核桿菌。與謝瑩瑩，梁卓夫等報道的以革蘭氏陰性菌為主相符[18]；與蘇州地區小兒下呼吸道感染以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌為主的報道不同[19]。馮燕玲等報道北京地區兒童呼吸道感染的主要病原菌為SP，HI，SA，SE，KP，與本研究相符。細菌檢出率與患兒性別有關，女性高于男性，與蘇州地區等報道的結果一致。且本研究中細菌檢出率隨年齡增長有下降趨勢，<1歲組患兒陽性檢出率最高，>7歲組兒童陽性檢出率最低，與其他地區的報道一致[19]，可能是由于幼兒的器官及生理功能尚未發育健全，呼吸道粘膜脆弱，粘膜血流量少，且自身免疫功能也尚未發育完善。本研究中，存在混合感染的標本為10例，占感染數的16.9%，高于之前的報道，最常見的合并感染為SA+HI+PA及KP+PA。以往研究中，關于肺炎支原體與病毒合并感染的報道較多，與細菌合并感染的報道較少，本研究中MP合并感染率為23.5%(4/17)，與Wujun Jiang等的報告比例(102/330，30.9%)類似[20]，最容易與KP合并感染。

綜上所述，本研究通過對2015年春季無錫地區兒童肺炎支原體及其他呼吸道常見致病菌的分析，肺炎支原體及其他呼吸道常見致病菌陽性檢測率為20.5%，其中肺炎支原體及肺炎克雷伯桿菌為主要致病菌，女性及<1歲組，細菌感染較其他組常見。由于肺炎支原體感染與其它兒童常見病原菌感染治療方案有差異且肺炎支原體耐藥率較高，了解本地區肺炎支原體與其它病原菌分布情況，有助于臨床醫生快速診斷，合理用藥，從而縮短療程，降低治療費用，避免濫用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產生。由于本研究標本收集時間段較短，病例數較少，對肺炎支原體耐藥與臨床病情之間的關系尚不明確，有必要進一步追蹤監測。

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Distribution ofMycoplasmapneumoniaeand respiratory pathogens in the specimen collected from Wuxi in the spring of 2015

CHANG Qing1, YAN Chao2, YU Rong1, GAO Yan-min1, OU YANG Bing1, SUN Hong-mei2

(1.DepartmentofPediatrics,WuxiNo.8People’sHospitalGroup,Wuxi214016,China;2.DepartmentofBacteriology,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

We explored the distribution ofMycoplasmapneumoniaeand other respiratory pathogens in the specimens collected from children with respiratory infection in Wuxi. PCR was used to detectMycoplasmapneumoniaeand 10 respiratory pathogens, and nPCR-SSCP-CE was used to detect the mutations associated with macrolide resistance. Results showed that one or more pathogens were detected in 59 of 288 specimens, and the positive rate was 20.5%. The children <2 years old and the female were susceptible. Results indicated that 28.8% (17/59) wereMycoplasmapneumoniae, 30.5% (18/59) were KP, 20.3% (12/59) were SA, 20.3% (12/59) were PA, 15.3% (9/59) were SE, 10.2% (6/59) were HI, 5.08% (3/59) were SP, 5.08% (3/59) were LP, and EC, CP, TB were 0%, respectively. The mutation rate of macrolide associate resistance toMycoplasmapneumoniaewas 88.2%, and the co-infection were detected in 10 specimens.The most common pathogens wereMycoplasmapneumoniaeand Kp in Wuxi and there was a high rate of macrolide resistance.

Mycoplasmapneumoniae; microlide resistance; respiratory pathogens; pediatrics; Wuxi

Sun Hong-mei, Email: s.hongmei@263.net

孫紅妹，Email：s.hongmei@263.net

1.江蘇省無錫市第八人民醫院兒科，無錫214016；2.首都兒科研究所細菌研究室，北京100020

R375

A

1002-2694(2016)07-0636-05

2015-12-04；

2016-02-14

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.009

無錫市衛生計生委婦幼健康科研項目(No.FYKY201505)