一起諾如病毒GⅡ.17型引起的急性胃腸炎病原學診斷及基因特征分析

姚　棟，陳靜芳，葉　文，歐新華

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一起諾如病毒GⅡ.17型引起的急性胃腸炎病原學診斷及基因特征分析

姚棟，陳靜芳，葉文，歐新華

目的對長沙市2014年12月某廠區暴發的一起急性胃腸炎疫情進行病原學診斷及對其致病原進一步的基因分型研究。方法共采集 6例病人肛拭子標本和可疑水源標本4份，提取核酸后，諾如病毒GI/GII型real-time RT-PCR試劑盒檢測；陽性標本普通RT-PCR擴增VP1基因片段，產物測序后BLAST比對確定其型別，并構建進化樹分析其進化關系。結果10份標本real-time RT-PCR擴增結果顯示為諾如病毒GII型，VP1區片段RT-PCR擴增后產物測序，BLAST比對發現與2014年香港諾如病毒株GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高，達99%，證實為諾如病毒GII.17型；構建系統進化樹分析顯示本次疫情分離的毒株與日本、香港、臺灣等亞洲地區的毒株親緣關系更為接近，而與美國、法國等地區的毒株親緣關系則較遠。結論諾如病毒是引起此次急性胃腸炎疫情的病原體，且引起暴發的病毒株屬于GII.17型。

諾如病毒；胃腸炎；分子分型

諾如病毒(Norovirus, NoV)，又稱諾瓦克樣病毒，屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是非細菌性急性胃腸炎的主要病原之一，被世界衛生組織定為B類病原，主要導致食源性及水源性急性腹瀉。目前世界范圍內超過50%的急性胃腸炎均是由NoV引起的，各個年齡段人群均普遍易感，在國內多個季節都可出現流行高峰[1-2]。NoV為單正鏈RNA病毒，基因組全長約7.7kb，包含3個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1編碼非結構蛋白，包括RNA聚合酶，ORF2和ORF3分別編碼主要(VP1)和次要(VP2)衣殼蛋白。根據VP1區基因序列的差異，NoV可分為GI-GVI 6個基因群，感染人類的主要為GI、GII群，其中GI群至少可分為14個基因型，GII群至少可分為21個基因型[3]。

研究顯示由NoV引起的感染性腹瀉中80%由GII群引起，而GII群中又以GII.4 型為主要基因型。自20世紀90年代諾如病毒首次導致世界性大流行以來，GII.4型一直在流行中占據主導地位[4]，其他基因型如GI、GII.3等型別也有報道，但多為小范圍流行或散發病例報道[5]。

2014年12月，長沙市暮云區一廠醫院報告近2周多名村民陸續出現嘔吐、腹脹腹瀉等胃腸道癥狀的病例，調查顯示該廠區及周邊居民采用自備水源(280 m深地下井)集中供水，根據臨床特點懷疑為水源性NoV引起的感染性腹瀉，采集6名患者肛拭子標本，4戶居民末梢水送實驗室進行相關檢測。

1　材料與方法

1.1標本采集6名患者肛拭子標本，Hank’s液中保存；250 mL無菌瓶分別在4戶居民家中采集末梢水200 mL，運送至實驗室進行檢測。

1.2主要試劑病毒RNA提取試劑盒QIAamp viral mini kit購自QIAGEN公司；諾如病毒GI/GII型real-time RT-PCR檢測試劑盒購自江蘇碩世生物有限公司；SuperScript○RⅢ One-Step RT-PCR with Platinum○RTaq試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3病毒核酸提取末梢水經抽濾濃縮后用于核酸提取，肛拭子標本振蕩混勻后直接用于核酸提取，具體操作方法參照試劑盒說明書進行。

1.4Real-time RT-PCR檢測取病毒RNA提取液5 μL用于檢測，諾如病毒real-time RT-PCR試劑盒定性檢測病毒GI/GII型，所用儀器為LC 480Ⅱ實時熒光PCR儀，檢測條件及GI、GII型結果的判斷參照試劑盒說明書進行。

1.5基因型別確定及序列分析參照相關文獻方法[6]擴增病毒VP1基因部分序列，所用引物序列如下，mon381: 5′-CCAGAATGTACAATGGTTATGC-3′，mon383: 5′-CAAGAG ACTGTGAAGACATCATC-3′，RT-PCR反應條件為：55 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，1個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，35個循環，68 ℃ 10 min。擴增片段大小為323 bp，

PCR產物送上海英俊公司進行序列測定，測序結果采用BLAST程序比對鑒定其型別，并上傳GenBank數據庫，序列登錄號為KR269694～ KR269703。選取GenBank中GII型諾如病毒VP1區序列，采用DNA Star軟件進行序列同源性分析，MEGA軟件通過鄰位法(Neighbor-Joining method)進行系統發生學分析，建樹的可靠性通過1000 bootstrap評估。

2　結　果

2.1Real-time RT-PCR核酸檢測10份標本核酸經real-time RT-PCR檢測，所有標本均出現典型“S”型擴增曲線，根據檢測試劑盒說明書判斷為諾如病毒GII型陽性。

2.2病毒型別的確定為確定病毒基因型別，采用特異性引物擴增病毒ORF2的VP1基因部分區域(圖1)，PCR產物測序后，與GenBank數據庫BLAST 比對分析，發現與2014年香港NoV GII.17型毒株 GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高，達99%，證實導致本次疫情暴發的諾如病毒基因型別為GII.17型。10份標本核苷酸序列同源性在96%～100%間，其中7份標本堿基序列完全一致；氨基酸序列與上述香港地區GII.17型毒株VP1蛋白序列相比(序列號AKB94550)，肛拭子標本Hu/14Y03/CS/CHN/2014第196、197位氨基酸發生變異，末梢水標本water/14Y03/CS/CHN、water/14Y04/CS/CHN第197位氨基酸發生變異(圖2)。

圖1　PCR擴增區域ORF結構示意圖Fig.1　ORF structures of VP1 gene PCR amplification fragments used in this study

圖2　NoV GII.17型VP1蛋白氨基酸序列比對圖Fig.2　Amino acid sequences alignment of NoV GII.17 VP1 protein

2.3遺傳進化樹分析從GenBank中選取NoV GII.17型、GI群及GII群其他型別病毒VP1基因序列，構建系統進化樹如圖3。本次疫情檢測到的10株GII.17型NoV在系統進化樹中形成一獨立的小分支，與2013年臺灣、2014年香港及2013-2015年日本等地區分離到的毒株親緣關系較近，而與美國、法國等國家則距離較遠，可能由于空間的距離，以及分離時間間隔較遠而導致系統進化上的差異。

圖3　NoV GII.17型VP1基因進化樹Fig.3　Phylogenetic analysis based on partial VP1 gene sequences of GII.17 NoV

3　討　論

NoV是一種變異頻繁的RNA病毒，其中GII.4型的變異頻率比其它基因型更高[7]，導致其在全世

界范圍內的廣泛流行，甚至暴發流行，自1995年以來共監測到7種引起大范圍暴發流行的GII.4型變異株；中國許多地區如北京、上海等地的報道也顯示GII.4型在NoV引起的急性胃腸炎中占大部分比例[8-9]，其他型別如GI型、GII.3、GII.14型等則流行程度較低，散發病例報道更常見[10]，而GII.17型流行的報道則較少見。本次由NoV引起的急性胃腸炎暴發疫情經序列分析證實為GII.17型，搜索GenBank中提交的NoV GII.17型序列，我們發現從2012年開始，大多提交的GII.17型序列來自韓國、日本、香港、臺灣、中國廣東等亞洲地區國家，說明從2012年開始，NoV GII.17型在亞洲地區流行開始增強，應引起重視。根據部分VP1基因序列構建的遺傳進化樹(圖3)顯示本次疫情NoV GII.17型與香港、日本、臺灣地區分離株親緣關系接近，可能為同一遺傳進化來源。

VP1蛋白是NoV的主要衣殼蛋白，主要與病毒結構的組裝、與宿主間的相互作用以及免疫應答的產生等生物學功能有關[11]；同時VP1蛋白也是病毒最易發生變異的區域，通過多序列比對我們發現污染的水樣標本中病毒VP1蛋白本身存在個別氨基酸的差異，而從一患者體內檢測到的病毒VP1蛋白則出現新的氨基酸突變位點(圖2，第196位氨基酸)，說明病毒在感染患者后，在與宿主相互作用過程中有新的突變產生。

NoV引起的腸胃炎可以通過人與人直接接觸、通過接觸污染的環境如食品、水等途徑傳播，NoV不同基因型對外界環境的抵抗力、與受體結合能力等生物學特性存在明顯區別[12]，導致不同基因型的流行病學特征不同，如GI型食源性傳播更常見，而GII.4型人與人之間直接傳播較為常見[13]。調查顯示本次疫情是由于NoV GII.17型污染末梢水管網引起，通過對末梢水消毒后發病例數明顯減少；有研究報道非洲肯尼亞河流中NoV分型顯示GII.17型占檢出陽性率的76%[14]，說明NoV GII.17型可能通過水源性的傳播風險較高，但具體流行病學特征還需大量的監測數據反映。

NoV在遺傳上的多樣性，主要是因為VP1蛋白的頻繁變異以及不同基因型間ORF1和ORF2的重組現象，本實驗中我們僅對NoV GII.17型VP1區部分序列進行了分析，ORF1區基因分型及全基因組序列還有待于進一步的研究。

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Etiology and genotype features analysis of an acute gastroenteritis outbreak associated with Norovirus GII.17

YAO Dong, CHEN Jing-fang, YE wen, OU Xin-hua

(ChangshaCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410001,China)

To identify the pathogens of an acute gastroenteritis outbreak in a factory of Changsha in December, 2014 and further analyze the genotypes of the pathogens. GI/GII norovirus of six anal swabs and four water samples were detected by real-time RT-PCR. The VP1 gene fragments of norovirus positive samples were then amplified and sequenced by RT-PCR with specific primers. BLAST alignment and phylogenetic analysis were performed based on the VP1 sequences. The ten specimens were tested norovirus GII positive and the VP1 sequences showed 99% homology with strain GII/Hu/HKG/2014/ GII.17/CUHK-NS-463 isolated in Hong Kong in 2014. It’s confirmed the norovirus genotype in this outbreak was GII.17. Phylogenetic analysis of viral VP1 sequences showed that the GII.17 norovirus in this study were closely related to strains circulating in Asian areas like Japan, Hong Kong and Taiwan, but a little far from those isolated in U.S.A and French which formed another cluster. The pathogen of this acute gastroenteritis outbreak was norovirus and the genotype was GII.17.

norovirus; gastroenteritis; genotype

Ou Xin-hua, Email: xhouteam@163.com

歐新華，Email: xhouteam@163.com

長沙市疾病預防控制中心，長沙410001

R373.3

A

1002-2694(2016)07-0641-03

2015-10-19；

2016-05-09

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.010