抗-HCV ELISA單陽、雙陽獻(xiàn)血者補(bǔ)充實驗及跟蹤分析研究

張艷梅，王新梅，郭喜彪，贠世文，姜燕娟，孟毓，王富強(qiáng)新鄉(xiāng)市中心血站，河南新鄉(xiāng)453000

抗-HCV ELISA單陽、雙陽獻(xiàn)血者補(bǔ)充實驗及跟蹤分析研究

張艷梅，王新梅，郭喜彪，贠世文，姜燕娟，孟毓，王富強(qiáng)
新鄉(xiāng)市中心血站，河南新鄉(xiāng)453000

目的對抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤檢測，了解其真實的病毒感染情況。方法對抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血3個月、6個月時采集標(biāo)本，進(jìn)行ELISA試驗、HCV PCR檢測及RIBA確證3種平衡檢測。結(jié)果36例單試劑陽性標(biāo)本中，1例跟蹤核酸檢測陽性，RIBA確證陽性。36例雙試劑陽性標(biāo)本中有20例確證陽性（55.6%），不確定11例（30.6%），陰性5例（13.9%），跟蹤結(jié)果無變化。結(jié)論應(yīng)盡快出臺并實施獻(xiàn)血者補(bǔ)充實驗的具體規(guī)定，確保血液安全，減少獻(xiàn)血者流失；在試劑的選擇上應(yīng)選擇特異性和靈敏度都高的試劑，無論選擇哪種檢測方式，建議ELISA方法應(yīng)選擇雙抗原夾心法，也希望盡快在獻(xiàn)血者中開展NAT和ELISA平行檢測，以有效降低輸血傳播感染病毒的風(fēng)險。

抗-HCV ELISA有反應(yīng)性；HCV-RNA檢測；RIBA檢測；補(bǔ)充實驗；跟蹤檢測

［Abstract］Objective To know their true virus infection by tracking and detecting the blood donors reactive to anti-HCV and ELISA.M ethods The specimens of blood donors reactive to anti-HCV and ELISA were collected at 3-month and 6-month after donating blood，and were given three balanced detections including ELISA test，HCV PCR test and RIBA confirmation.Results In 36 cases of sero-concordant specimens，1 positive case was detected by tracking nucleic acids，and 1 positive case was confirmed by RIBA.In 36 cases of sero-discordant specimens，20 positive caseswere confirmed（55.6%），11 caseswere uncertain（30.6%），5 caseswere negative（13.9%），and the tracking results had no change.Conclusion We should make and implement specific regulations of complementary experiment of blood donors as soon as possible to ensure the blood safety and reduce the loss of blood donors，and choose the reagentwith higher specificity and sensitivity degree，the double antigen sandwich method in ELISA method is suggested to be selected whichever detection method we choose and we hope to carry out NAT and ELISA parallel detection for donors as soon as possible thus effectively reducing risks of transfusion-transmitted infection virus.

［Key words］Reactive to anti-HCV and ELISA；HCV-RNA detection；RIBA detection；Complementary experiment；Trace detection

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有三四百萬人感染丙肝病毒，有1.3億～1.7億人患丙型肝炎。在我國，丙肝患者約有4000萬人，丙肝發(fā)病率在所有病毒性肝炎中僅次于乙肝［1］。為控制HCV經(jīng)血液傳播，我國規(guī)定采用兩家ELISA抗體診斷試劑篩選獻(xiàn)血者丙型肝炎抗體或采用1種ELISA試劑檢測HCV抗體，采用1種試劑檢測HCV核酸［2］。對有反應(yīng)性的血液及其制備的所有成分報廢，并將該獻(xiàn)血者實施獻(xiàn)血屏蔽和淘汰，為了解其真實的感染情況，我們對部分抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行補(bǔ)充實驗和跟蹤檢測，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

2013年8月—2014年6月新鄉(xiāng)市無償獻(xiàn)血者進(jìn)行初篩實驗有反應(yīng)性標(biāo)本44例，（初篩試劑為抗HCV ELISA間接法（上海科華和廈門新創(chuàng)）和雙抗原夾心法（北京萬泰））；2014年6月—2014年10月無償獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HCV ELISA初篩試驗有反應(yīng)性標(biāo)本28例（初篩試劑為抗HCV ELISA間接法（廈門新創(chuàng)）和雙抗原夾心法（北京萬泰））。其中抗-HCV ELISA 2次檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本（單試劑陽性）36例，雙試劑陽性36例，分別在其獻(xiàn)血間隔3月、6月后電話追蹤，預(yù)約靜脈采樣進(jìn)行檢測。獻(xiàn)血者年齡18～55歲，男性占61%（44/ 72），女性占39%（28/72）。

1.2標(biāo)本采集

電話預(yù)約在本站采血點采集靜脈血樣，留取核酸檢測標(biāo)本及血清學(xué)檢測標(biāo)本各5mL，及時分離血清/漿，并存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與設(shè)備

①血液篩查ELISA診斷試劑：上海科華、廈門新創(chuàng)、北京萬泰雙抗原夾心試劑。所有試劑均經(jīng)中國藥品生物制品檢定所批批檢合格，并在有效期內(nèi)使用。②確證試驗試劑：抗-HCV重組免疫印跡試驗（RIBA）：北京萬泰公司產(chǎn)品（RC20140101）。③核酸檢測試劑：上海科華生物工程股份有限公司（14042511）。④設(shè)備：RSP150全自動加樣系統(tǒng)、EVO全自動加樣系統(tǒng)（瑞士TECAN），F(xiàn)AME24/20全自動酶免處理系統(tǒng)（瑞士Hamilton）BEP150全自動酶免分析儀（德國貝林），HT3酶標(biāo)儀，340RT溫控酶標(biāo)儀（奧斯幫生物工程有限公司），全自動蛋白印跡儀PROFIBLOT48（瑞士TECAN），美國ABI 7500實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

1.4檢測方法

為了解ELISA篩查有反應(yīng)性獻(xiàn)血者的真實感染情況，我們對抗-HCV ELISA初篩試驗有反應(yīng)性標(biāo)本分為2次檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本（單試劑陽性）和雙試劑陽性兩組，分別對其3個月、6個月的標(biāo)本采用了ELISA試驗、HCV PCR檢測及RIBA確證3種平衡檢測方案。

1.4.1ELISA檢測，對隨訪到的獻(xiàn)血者均進(jìn)行ELISA檢測。選用不同生產(chǎn)廠商ELISA試劑檢測2次，雙試劑有反應(yīng)判定為陽性，單試劑有反應(yīng)再用相同試劑做雙孔復(fù)查，雙孔有反應(yīng)或單孔有反應(yīng)判定為陽性，反之判為陰性。

1.4.2HCV-RNA檢測采用美國ABI7500實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果≥103 IU/mL為陽性。1.4.3 RIBA確證試驗抗-HCV RIBA確證采用重組免疫印跡實驗（RIBA），未出現(xiàn)HCV抗體特異條帶強(qiáng)度1+及以上判為陰性，至少出現(xiàn)兩種HCV抗體特異條帶（Core、NS3、NS4和NS5）強(qiáng)度1+及以上判為陽性，僅出現(xiàn)一種HCV抗體特異條帶（Core、NS3、NS4和NS5）強(qiáng)度1+及以上判為不確定。

2　結(jié)果

44份標(biāo)本RIBA及抗-HCV ELISA結(jié)果見表1，抗-HCV ELISA單試劑陽性標(biāo)本的確證結(jié)果和NAT結(jié)果見表2，雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測結(jié)果見表3。

表1　44份標(biāo)本RIBA及抗-HCV ELISA結(jié)果

2014年6月—2014年10月ELISA有反應(yīng)性標(biāo)本28例，其中RIBA陽性10例，RIBA不確定7例，RIBA陰性11例。

表2　36例抗-HCV ELISA單試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測結(jié)果

表3　36例抗-HCV ELISA雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測結(jié)果

2　結(jié)果說明

①36例雙試劑陽性標(biāo)本中有20例確證陽性（55.6%），不確定11例（30.6%），陰性5例（13.9%），跟蹤結(jié)果無變化。②36例單試劑陽性標(biāo)本中，有1例跟蹤核酸檢測陽性，RIBA確證陽性，有14例RIBA不確定，經(jīng)跟蹤不確定結(jié)果無變化。

3　討論

該研究跟蹤的ELISA篩查有反應(yīng)性獻(xiàn)血者，分別在3個月、6個月進(jìn)行相關(guān)抽樣檢測，旨在確保抗-HCV病毒檢出前的窗口期。2001年6月召開的血液制品咨詢委員會（Blood Products Advisory Committee，BPCA）會議上報告的數(shù)據(jù)證實，6個月的等待期已足以涵蓋HCV感染血清陽轉(zhuǎn)前的窗口期［3，4］。目前，國內(nèi)大多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)未實施HCV NAT檢測，更未對抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者作RIBA確證試驗。單單由ELISA篩查“抗-HCV有反應(yīng)性”屏蔽獻(xiàn)血者，特別是一些長期獻(xiàn)血者。容易給獻(xiàn)血者帶來心理負(fù)擔(dān)，造成對無償獻(xiàn)血工作的誤解，引起對血站的抱怨和投訴。根據(jù)表2可以看出，ELISA篩查單試劑有反應(yīng)性者中有58.3%（21/36）均為潛在的合格獻(xiàn)血者，略低于龐棟等報告的69.4%［5］，高于劉天宇等在血液篩查抗-HCV假陽性獻(xiàn)血者回歸的調(diào)查分析報道的54.88%［6］。WHO發(fā)布的《篩查獻(xiàn)血者血液經(jīng)輸血傳播感染的建議書》要求血站實驗室開展篩查和確證試驗，分別用于血液篩查和獻(xiàn)血者管理［7］。目前美國、英國、澳大利亞等國均對此類獻(xiàn)血者的補(bǔ)充實驗及回招標(biāo)準(zhǔn)做了明確規(guī)定［3，4］。鑒于此，我們建議相關(guān)部門盡快出臺此類獻(xiàn)血者進(jìn)一步補(bǔ)充實驗的具體規(guī)定，明確時間間隔，規(guī)范檢測流程。國外研究表明，RIBA不確定者在隨訪過程中一般轉(zhuǎn)為陰性或者繼續(xù)保持不確定結(jié)果，即判為假陽性結(jié)果［8-10］。該研究中共有25例不確定標(biāo)本，在隨后的跟蹤檢測中仍然保持不確定結(jié)果，因此，判定為假陽性。

目前多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)使用第三代國產(chǎn)間接法檢測試劑，由于受到非特異性抗體的影響較大，易造成假陽性.隨著丙肝重組抗原技術(shù)的進(jìn)步，采用雙抗原夾心法檢測丙肝抗體的理念也得以實現(xiàn)，由表1可知，科華、新創(chuàng)、萬泰3個廠家的抗-HCV有反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)RIBA實驗確證后，假陽性率分別為31%（5/16）、63%（10/16）、13%（2/16），萬泰雙抗原夾心法明顯優(yōu)于其他兩種試劑。雙抗原夾心法抗-HCV ELISA是檢測抗-HCV總抗體，既縮短了“窗口期”，又可以降低間接法引起的假陽性。因此，在試劑的選擇上應(yīng)選擇特異性和靈敏度都高的試劑，無論采用兩家ELISA抗體診斷試劑篩選獻(xiàn)血者丙型肝炎抗體或采用1種ELISA試劑檢測HCV抗體，1種試劑檢測HCV核酸，建議ELISA方法應(yīng)選擇雙抗原夾心法。也希望在獻(xiàn)血者中開展NAT和ELISA平行檢測，以有效降低輸血傳播感染病毒的風(fēng)險。

在對36例抗-HCV ELISA雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測中發(fā)現(xiàn)有RIBA陽性20例，NAT陽性12例。理論上，血清中即使存在1個病毒核酸分子，都能通過NAT方法檢測出來，但在實際工作中，往往由于血清中病毒核酸含量太少導(dǎo)致核酸提取失敗、PCR試劑的檢測靈敏度、樣本和擴(kuò)增體系中可能存在某些抑制病毒核酸擴(kuò)增的因素等均可能影響病毒核酸的檢出［11］，但考慮到是無償獻(xiàn)血人群，更有可能與獻(xiàn)血者HCV病毒血癥消退等因素有關(guān)，尚需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

在對36例單試劑陽性者追蹤中發(fā)現(xiàn)有1例出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，證實獻(xiàn)血者當(dāng)時處于病原體感染的窗口期，因此，對ELISA篩查單試劑陽性獻(xiàn)血者血液實施報廢處置及獻(xiàn)血者實施6個月的屏蔽期是非常有必要的，值得引起重視。

［1］《丙型肝炎感染者調(diào)查、關(guān)護(hù)和治療指南》.世界衛(wèi)生組織. 2014年4.

［2］《血站技術(shù)操作規(guī)程》2012版.

［3］郭永健，姚鳳蘭，林授，等.HIV-1和HCV核酸檢測血液處置和獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊指引（上），中國輸血雜志，2011，24 （1）:79-85.

［4］葛紅衛(wèi)，林授，汪德海，等.HIV-1和HCV核酸檢測血液處置和獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊指引（下），中國輸血雜志，2011，24 （2）:172-176.

［5］龐棟，申衛(wèi)東，張翙，等.ELISA篩查單試劑反應(yīng)獻(xiàn)血者追蹤檢測，中國輸血雜志，2014，27（4）:381-383.

［6］劉宇寧，蔡菊英，劉曉音.血液篩查HBsAg、抗-HCV假陽性獻(xiàn)血者歸隊的調(diào)查分析.中國輸血雜志，2012，25（3）:260-262.

［7］WHO.Screening donated blood for transfusin-transmissible infections（Recommen dations）.Geneva，2009:50-52.

［8］Centers for Disease Control and Prevention.Recommendations for pre-vention andcontrol of hepatitis C virus（HCV）infection and HCV-re-lated chronic disease.MMWR Recomm Rep，1998，47（RR-19）:1-39.

［9］Lemaire JM，Courouce AM，Defer C，etal.HCV RNA in blood donors with isolated reactivities by third-generation RIBA. Transfusion，2000，40（7）:867-870.

［10］Stefania CMartin L.Lndeterminate third-generation hepatitis C recombinant immunoblot assay and HCV RNA analysis:isolated reactivitiy againstwith HCV viraemia in clinical patients but not bloods.Scand J Infect Dis，2005，37（6-7）: 488-492.

［11］李文新.不同方法試劑檢測丙型肝炎病毒抗體結(jié)果分析.中國輸血雜志，2014，27（6）:622-624.

Research on Com p lementary Experiment and Tracking Analysis of Anti-HCV and ELISA Sero-concordant and Sero-discordant Blood Donors

ZHANG Yan-mei，WANG Xin-mei，GUO Xi-biao，YUAN Shi-wen，JIANG Yan-juan，MENG Yu，WANG Fu-qiang
Xinxiang Central Blood Station，Xinxiang，Henan Province，453000 China

R7

A

1672-5654（2016）06（a）-0043-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.16.043

新鄉(xiāng)市科技發(fā)展計劃項目（項目編號：14SF13）。

張艷梅（1972.2-），女，河南新鄉(xiāng)人，本科，副主任技師，主要從事血液檢驗及質(zhì)量管理。

2016-03-21）