豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的抗氧化活性研究

唐宏剛，肖朝耿，葉夢迪，朱培培，陳黎洪*（浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江杭州310021）

豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的抗氧化活性研究

唐宏剛，肖朝耿，葉夢迪，朱培培，陳黎洪*
（浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江杭州310021）

以豬骨蛋白酶解液和葡萄糖（或木糖）為原料，100℃水浴加熱120 min以制備美拉德反應產物，采用超濾分離產物獲得不同分子量范圍（＜1、1～5、5～10、＞10 ku）的組分，研究各分離組分的體外抗氧化活性。結果表明，不同組分均具有一定的抗氧化活性，其中分子量＞10 ku的組分具有較高的DPPH自由基清除能力、還原能力以及Fe2+螯合活性，表明高分子量美拉德反應產物的抗氧化能力更強。葡萄糖、木糖組產物的自由基清除能力、還原能力以及Fe2+螯合活性差異均不顯著（P＞0.05），說明還原糖結構對該研究制備的美拉德反應產物的抗氧化活性未產生明顯影響。

豬骨蛋白酶解液；美拉德反應產物；抗氧化活性

中國是世界第一肉類生產大國，年總產量超8 000萬t，其中，畜禽鮮骨達2 000多萬t。研究表明，骨中的蛋白質和脂肪含量與等量鮮肉相似，鈣、磷等礦物元素的比例合理，并富含磷脂質、磷蛋白、維生素等，是一類營養價值相當高的畜禽副產品［1］。骨蛋白是較為全價的可溶性蛋白質，氨基酸比例均衡，生物學效價高，屬于優質蛋白［2］。國內外學者針對畜禽骨蛋白的利用研究主要集中在蛋白提取及酶解條件參數的優化、酶解產物功能特性與活性分析等，并取得了較大進展［3-5］。

美拉德反應是指含游離氨基的化合物與含羰基化合物之間的非酶促褐變反應，廣泛存在于食品的貯藏與加工過程［6］。美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）中含有類黑精、還原酮類及一系列揮發性雜環化合物，其中，呈褐色的高分子量成分——類黑精對產物的色澤與抗氧化活性具有重要的貢獻［7］。研究表明，動物蛋白酶解物可與還原糖進行美拉德反應，其產物除呈現一定的風味特征外，還具有較好的體外抗氧化活性［8-10］。

目前，畜禽骨蛋白水解物與還原糖的美拉德反應產物的抗氧化特性已有報道［11］，而對產物中不同分子量組分的抗氧化活性缺乏深入研究。本研究以資源豐富的豬骨為原料制備蛋白酶解液，并與不同結構的還原糖進行美拉德反應，采用膜分離手段獲得不同分子量范圍的反應產物組分，通過體外試驗研究各組分的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬骨購于食品市場；中性蛋白酶購于無錫杰能科生物工程有限公司；風味蛋白酶購于諾維信公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購于Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的制備

豬骨蛋白酶解液（PBPH）制備：豬骨經清洗、破碎后高壓蒸煮，然后進行離心分離、濃縮、去脂，采用m（中性蛋白酶）∶m（風味蛋白酶）=2∶1的復合酶進行酶解，其酶解條件為料液比1∶5，加酶量3%，pH 7.0，酶解溫度45℃，時間3 h。酶解結束后滅酶、離心，取上清液。

美拉德反應產物制備：取定量葡萄糖（或木糖）與豬骨蛋白酶解液作為反應底物，混合攪拌均勻，用1 mmol·L-1NaOH調整溶液初始pH值至7.8，再轉移至具塞玻璃試管中，置于100℃水浴加熱120 min。

1.3 不同分子量范圍MRPs的分離

將所制備的產物用冰水浴降溫，1 500 g離心15 min。通過實驗用膜分離裝置MSM-1812（上海摩速科學器材有限公司）以中空纖維超濾膜對MRPs進行超濾處理，選擇的濾膜截留分子量分別為1、5、10 ku，至少重復3次。獲得的不同分子量范圍組分經旋轉蒸發濃縮，再冷凍干燥，4℃保存用于分析。

1.4 DPPH自由基清除率

參照Tepe等［12］的方法并作適當修改。取0.2 mL待測MRPs樣品溶液（濃度10 mg·mL-1，加入0.8 mL 0.2 mmol·L-1DPPH甲醇溶液，混勻，在室溫下置于暗處反應30 min，測定其517 nm處的吸光度。按照公式（D0-D1）/D0×100計算清除率，其中D0指不加入樣品時的吸光度，D1為加入樣品后的吸光度。

1.5 超氧陰離子清除能力

參考Marklund等［13］的方法測定。取0.1 mL MRPs樣品溶液，加入2.8 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），混勻后25℃水浴保溫10 min。然后加入0.1 mL經25℃水浴預熱的3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，混勻并計時，測定325 nm處吸光度，空白管以蒸餾水代替。每隔30 s讀取1次，5 min后結束，計算鄰苯三酚的自氧化速率。按公式（V0-Vi）/V0×100計算鄰苯三酚自氧化的抑制率，其中，V0為空白組鄰苯三酚自氧化速率（ΔD/min）；Vi為加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率（ΔD/min）。

1.6 還原能力

參照Oyaizu［14］的方法并略作改動。取1 mL MRPs樣品溶液，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol·L-1，pH 6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀溶液（1 g·100mL-1）。將混勻的溶液于50℃水浴中保溫20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10 g·100mL-1），混勻后離心10 min。取2.5 mL上清液，加入0.5 mL三氯化鐵溶液（0.1 g· 100mL-1）和2.5 mL蒸餾水搖勻，靜置10 min后，在700 nm波長處測定吸光度。

1.7 Fe2+螯合活性

參考Dinis等［15］的方法并稍作修改。取 1 mL樣品溶液，加入1.85 mL蒸餾水與0.05 mL 2 mmol·L-1FeCl2溶液，混勻靜置30 s。然后再加入0.1 mL 5 mmol·L-1菲洛嗪溶液并混勻，反應10 min，于562 nm處測定吸光度。Fe2+螯合活性計算方法為螯合活性（%）=（1-DS/DB）×100，其中DS、DB分別為樣品、空白組的吸光值。

1.8 數據分析

采用SPSS 13.0軟件，對數據進行差異顯著性方差分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除率

DPPH是衡量各種抗氧化物質清除自由基能力的常用反應底物。DPPH自由基在甲醇溶液中比較穩定，當從加入的抗氧化劑中接收電子或者氫原子，自由基將被清除，從而導致517 nm處的吸光度下降［16］。在本研究中，分子量＞10 ku的組分 DPPH自由基清除率最高（57.25% ～59.42%），但5～10 ku組分DPPH自由基清除率相對最低（39.64%～41.21%）（圖1）。MRPs中具有DPPH自由基清除作用的有效成分主要為水溶性物質而非醇溶性［17］，因此，推測5～10 ku組分中醇溶性物質含量較高。鑒于產物組分的復雜性，具體原因有待于進一步分離并深入研究。經統計分析，葡萄糖、木糖組的產物DPPH自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），表明還原糖結構對豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的DPPH自由基清除能力未產生明顯影響。

2.2 超氧陰離子清除能力

圖1 豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH radical scavenging pecentage of MRPs derived from PBPH

2.3 還原能力

還原能力是評判物質抗氧化活性高低的重要指標，一般與抗氧化能力呈正相關。在還原力測定過程中，樣品還原劑將3價鐵離子（Fe3+）/鐵氰化物復合物轉變為亞鐵離子（Fe2+）形式，Fe2+的產生通過測定 700 nm處吸光值進行檢測［20］。

圖2 豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的超氧陰離子清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging ability of MRPs derived from PBPH

由圖3可以看出，不同分子量范圍的豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物均具有一定的還原能力，其中，分子量＞10 ku的組分還原力較強，葡萄糖、木糖組D700分別為0.651和0.694。已有研究發現，高分子量的類黑精組分具有更高的褐變程度和還原能力［21］，這在本研究中也得到了證實。與DPPH自由基、超氧陰離子清除能力類似，木糖組產物的還原能力在數值上高于葡萄糖組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 Fe2+螯合活性

金屬離子可催化超氧陰離子產生羥自由基，加快機體氧化衰老進程；而抗氧化劑能夠通過螯合金屬離子抑制自由基形成。不同分子量范圍豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的Fe2+螯合活性見表1。從表1可以看出，隨著分子量增加，Fe2+螯合活性呈上升趨勢，分子量＞10 ku組分的螯合活性顯著高于其他范圍的組分（P＜0.05）。在相同分子量范圍內，木糖與葡萄糖組產物組分的Fe2+螯合活性沒有顯著差異（P＞0.05）。Gu等［22］研究表明，酪蛋白—葡萄糖MRPs超濾后所得的高分子量（＞30 ku）組分螯合Fe2+作用較強，低分子量組分則不具有螯合活性。在本研究中，低分子量MRPs組分仍顯示出Fe2+螯合活性，并且1～5、5～10 ku組分的螯合活性均顯著高于分子量 ＜1 ku的組分（P＜0.05）。這與孫常雁等［23］的研究結果一致，原因可能是低分子量組分中含有肽類物質，而肽能對金屬離子有一定程度的螯合作用。

圖3 豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的還原能力Fig.3 Reducing power of MRPs derived from PBPH

表1 豬骨蛋白酶解液美拉德反應產物的Fe2+螯合活性Table 1 Fe2+chelating activity of MRPs derived from PBPH

3 結論

本研究表明，豬骨蛋白酶解液與葡萄糖、木糖的美拉德反應產物均呈現出較好的抗氧化活性，2者之間差異不顯著；不同分子量范圍的反應產物活性表現出一定的差異，分子量＞10 ku組分的DPPH自由基清除率、還原能力以及Fe2+螯合活性均最高，表明高分子量美拉德反應產物具有更強的抗氧化作用。上述研究結果為豬骨蛋白酶解液的美拉德反應產物作為食品抗氧化劑提供了理論依據，對實現畜禽副產物的增值利用具有重要意義。

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（責任編輯 侯春曉）

Study on antioxidative activity of Maillard reaction products derived from porcine bone protein hydrolysates

TANG Hong-gang，XIAO Chao-geng，YE Meng-di，ZHU Pei-pei，CHEN Li-hong*
（Institute of Food Science，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

Maillard reaction products（MRPs）were prepared by the reaction of porcine bone protein hydrolysates （PBPH）and glucose or xylose.MRPs were isolated to fractions with different molecular weights（＜1，1-5，5-10，＞10 ku）by ultrafiltration.The antioxidative activity of the fractions was determined in vitro，respectively.The results showed that all fractions exhibited antioxidative activity，especially the fractions（MW＞10 ku）had the highest DPPH radical scavenging ability，reducing power and Fe2+chelating activity.It revealed that antioxidative activity of MRPs with high molecular weight were more efficient.The differences of radical scavenging ability，reducing power and Fe2+chelating activity between MRPs derived from glucose and xylose were not significant（P＞0.05），indicating that sugar structure showed no effect on antioxidative activity of MRPs prepared in this study.

porcine bone protein hydrolysates；Maillard reaction products；antioxidative activity

TS251.94

A

1004-1524（2016）08-1396-05

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.18

2015-12-15

浙江省自然科學基金項目（LY12C20016）

唐宏剛（1980—），男，江蘇鹽城人，博士，副研究員，主要從事畜產品加工、食品化學研究工作。E-mail：zaastang@163.com
*

，陳黎洪，E-mail：cwc528@163.com