稻瘟病菌孢子qPCR方法的建立及用于監測氣傳菌源的研究

許燎原，趙麗穩，胡宇峰2，邱海萍3，柴榮耀3，張 震（.寧波市種植業管理總站，浙江寧波3502；2.浙江省寧?？h農業技術推廣總站，浙江寧海35600；3.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州3002）

稻瘟病菌孢子qPCR方法的建立及用于監測氣傳菌源的研究

許燎原1，趙麗穩1，胡宇峰2，邱海萍3，柴榮耀3，張 震3，*
（1.寧波市種植業管理總站，浙江寧波315012；2.浙江省寧海縣農業技術推廣總站，浙江寧海315600；3.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州310021）

稻瘟病是水稻生產中最具毀滅性的真菌病害之一，監測田間空氣中稻瘟病菌分生孢子數量動態變化，對于預測病情發生和指導及時防治具有重要意義。該研究以稻瘟病菌MHP1基因為靶序列，建立了1種稻瘟病菌分生孢子qPCR定量方法，并采用此方法對田間氣傳稻瘟病菌源進行了監測。監測數據顯示，監測期間空氣中稻瘟病菌分生孢子數量波動幅度較大。結合氣象條件進行分析，菌源量的波動與氣象條件相關。該研究建立的孢子qPCR方法可應用于監測氣傳稻瘟病菌源。

稻瘟??；分生孢子量；孢子捕捉；qPCR；氣象因子

由子囊菌Magnaporthe oryzae侵染引起的稻瘟病是水稻生產中最具毀滅性的真菌病害之一［1］，該病屬于單年多循環病害，病稻草上的越冬菌源和當年病斑上產生的分生孢子經由氣流傳播是稻瘟病發生的初侵染源和再侵染源。因此，及時監控稻田空氣中的稻瘟病菌源量，可以為有效進行病害的控制和管理提供依據。

長期以來，空氣中稻瘟病菌源監測以凡士林玻片或旋轉式孢子捕捉器等捕捉樣品的顯微計數為主［2-3］。顯微計數不僅工作量大，而且鑒于環境樣品的復雜性，包含固體顆粒物和形態近似孢子等，顯微計數的結果可能與實際情況存在較大偏差?；赥aqman的qPCR技術，以其特異性強、靈敏度高、重復性好、速度快等優點已廣泛應用于植物病原菌的定量監測［4］。這些菌源定量監測方法通常以病原真菌的rDNA區域保守序列為靶標設計特異性的Taqman探針［5-6］。但由于這些序列與病原菌的致病性無關，其用于監測環境樣本中致病菌源量，所得數據中包含大量的非致病菌，不利于病害的準確預測。如將與病菌致病性相關的特異性標記結合應用于病害的流行預警，所得數據更具可靠性。近來，Su'udi等［7］根據稻瘟病菌致病相關基因MHP1設計了用于稻瘟病菌菌量檢測的Taqman探針，并成功實現了對病害嚴重度的比較。基于他們的研究結果，本研究研發空氣傳播的稻瘟病分生孢子定量檢測方法，并開展水稻生育期內稻瘟病菌空氣傳播分生孢子數量的動態監測，對及時預測田間病害發生情況具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

稻瘟病菌菌株12-10-1和小麥赤霉病菌12-02均由浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所糧食作物病害研究室分離保存。

稻瘟病菌分生孢子獲得：濾紙片上保存的菌株于CM平板28℃活化后，切取適量菌塊接種到CM平板，28℃、12 h（L）/12 h（D）光暗交替培養8 d。平皿內倒入適量無菌水，用高壓滅菌的毛筆輕刷菌落，吸取菌懸液經4層滅菌擦鏡紙過濾，濾液經2 500 g離心10 min收集分生孢子，加入適量TE溶液重懸分生孢子，用血球計數板計數后調整孢子濃度至1.5×107個·mL-1，-20℃保存待用。

小麥赤霉病菌菌株于PDA平板28℃活化后，切取適量菌塊于100 mL 4%綠豆湯培養液中，25℃150 r·min-1振蕩培養5 d。吸取菌液經4層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液經2 500 g離心收集分生孢子，加入適量TE溶液懸浮，用血球計數板計數后調整孢子濃度至1.5×107個·mL-1，-20℃保存待用。

1.2 主要儀器與試劑

7500型實時熒光定量PCR儀和Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒，用于核酸的定量檢測，分別為美國Applied Biosystems公司和TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產品。Fastprep-24和酸洗玻璃珠（425—600 μm）用于分生孢子的機械破壁，分別購自美國MP Biomedicals公司和Sigma-Aldrich公司。7 d孢子捕捉儀，用于田間空氣傳播的稻瘟病菌分生孢子捕捉，是英國Burkard Scientific公司產品，屬吸入式7 d連續孢子捕捉儀，進氣量10 L·min-1。HOBO u30小型自動氣象站，用于田間小氣候自動監測與記錄，為美國Onset公司的產品。

1.3 稻瘟病菌分生孢子基因組DNA的提取

用TE溶液對上述稻瘟病菌孢子液進行10倍梯度稀釋，配制1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103和1.5×102個·mL-1稻瘟病菌孢子懸浮液。對4個懸浮液中稻瘟病菌孢子濃度不足1.5×107個·mL-1，用赤霉病菌孢子母液進行補充，使得各懸浮液中真菌孢子量保持一致。取上述不同濃度的稻瘟病菌孢子懸浮液400 μL用于提取基因組DNA。DNA提取相關試劑及過程參見Ward［8］的方法。

1.4 引物及熒光探針設計

引物和 Taqman探針參照 Su'udi等［7］的序列。引物序列為（MHP1F1）5′-TCGATGCCGACAACTTCTCCG-3′和（MHP1R1）5′-ACCCTGGTCAAGCTGTTCGATTGT-3′；探針序列：5′-TGCCCATCGTAAGTTCCTTCTTCGCA-3′，其中5′和3′分別采用FAM和TAMRA進行修飾。上述引物探針均由美國Invitrogen公司合成。

1.5 qPCR擴增體系

qPCR擴增體系和反應程序參照TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒操作說明，略有改動。反應體系為2× Premix Ex TaqTM10 μL、10 μmol·L-1上下游引物及探針溶液各0.4 μL、50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 6.4 μL，總體積為20 μL。反應程序采用2步法。qPCR結果利用7500熒光定量PCR儀自帶軟件SDS（版本v2.0.4）進行分析。

1.6 田間空氣中稻瘟病菌孢子的捕捉

孢子捕捉點位于浙江省寧?？h茶院鄉稻作區（121.42°E，29.3°N）。周邊種植的水稻品種以甬優系列秈粳雜交水稻為主。7 d孢子捕捉儀進氣口距地面1.2 m。捕捉儀整年開啟，每隔7 d更換用于收集樣品的聚酯片。取下的聚酯片進行7等分，每份即為1 d的孢子捕捉樣品。將每份聚酯片剪成2 mm寬的窄條裝于2 mL離心管內，并用Ward［8］的方法提取基因組DNA，最終獲得50 μL的DNA溶液。

1.7 田間小氣候條件的監測

HOBO u30小型氣象站安裝于7 d孢子捕捉儀旁，整年開啟，實時監測并記錄取樣點溫度、降雨量、相對濕度和風速等氣象數據。

圖1 稻瘟病菌分生孢子定量標準曲線Fig.1 Standard curve used for quantifying rice blast spore

2 結果與分析

2.1 稻瘟病菌分生孢子定量標準曲線的建立

取上述1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5× 104、1.5×103和1.5×102個·mL-1的稻瘟病菌分生孢子懸浮液400 μL，分別相當于取6×106、6× 105、6×104、6×103、6×102和60個稻瘟病菌分生孢子，用于提取基因組DNA，最終各樣品均獲得50 μL的DNA溶液。分別取2 μL作為模板進行qPCR分析，結果顯示，除孢子濃度為1.5×102個·mL-1的樣品外，其他5個樣品擴增曲線明顯，平均Ct值分別為21.68、25.82、30.27、33.09和35.14。據Su'udi等［7］報道，檢測下限為1 pg稻瘟病菌基因組DNA，按1 pg基因組DNA=0.978× 109bp計算［9］，稻瘟病菌基因組大小約40 Mbp，分生孢子具有3個細胞，其理論最低可檢出8個稻瘟病菌分生孢子。本研究中，孢子濃度為1.5× 102個·mL-1的樣品沒有擴增曲線，這與其孢子數量低于Su'udi等［7］報道的最低檢測下限相符合。對5個有擴增結果的樣品，按孢子數量的lg值與平均Ct值進行線性回歸，結果顯示具有良好的相關性，R2=0.977 9（圖1）。

2.2 空氣中孢子捕捉樣品的檢測

對2012年6月7日—10月28日采集的21批次空氣中稻瘟病菌分生孢子捕捉樣品進行了檢測。收集的聚酯片按天進行等距分割，并提取基因組DNA，每天樣品獲得50 μL的DNA溶液。每個樣品取2 μL，進行qPCR檢測，獲得各樣品的Ct值。根據上述稻瘟病菌分生孢子定量的標準曲線，計算各PCR樣品所對應的稻瘟病菌分生孢子數量，然后根據7 d捕捉儀每天吸氣14 400 L，計算每立方空氣中所含的稻瘟病菌分生孢子數量。結果顯示，2012年6月7日—10月28日，稻田空氣中稻瘟病菌分生孢子數量呈現明顯的動態變化（圖2），在孢子監測的144 d中有64 d未檢測到稻瘟病菌分生孢子，其中有53 d集中在8月25日至10月28日；而稻瘟病菌分生孢子釋放主要集中在6月7日至8月24日，檢出的分生孢子數量為16.9～825.3 cfu·m-3空氣，其中，8 月9日檢出孢子數量最多。

2.3 空氣中稻瘟病菌孢子數量與氣象因子的關系

生物學研究表明，稻瘟病菌菌絲可以在8～37℃生長，適宜溫度為26～28℃；分生孢子在10～35℃均可形成，最適溫度為25～28℃。根據HOBO u30氣象站數據，2012年6月7日至10 月28日，日平均氣溫為14.4～30.9℃，日最高氣溫為37.4℃，日最低溫度除了10月18日、19日、23日和24日外均在10℃以上（圖2），此溫度條件下稻瘟病菌均能夠生長和產孢。自然條件下，稻瘟病菌分生孢子大多數在夜間產生和釋放，特別是在2：00—6：00［8］。定量監測結果顯示，稻瘟病菌分生孢子釋放主要集中在6月7日至8月24日，8月25日至10月28日監測到的孢子數量較少，僅有12 d可監測到稻瘟病菌孢子的存在。對每天夜間2：00—6：00的平均氣溫進行分析發現，6月7日至8月24日的氣溫為24～28℃，是稻瘟病菌的最適產孢溫度；而8月25日至10月28日的絕大部分時間氣溫都低于20℃，不利于稻瘟病菌分生孢子的產生和釋放。

圖2 稻瘟病菌分生孢子數量與氣溫的動態變化Fig.2 Dynamic changes of temperature and number of rice blast spore

圖3 稻瘟病菌分生孢子數量與空氣相對濕度的動態變化Fig.3 Dynamic changes of relative air humidity and number of rice blast spore

稻瘟病菌分生孢子產生需要較高的相對濕度。本研究中，6月7日至10月28日中有79 d日平均相對濕度在60.5%以上，且絕大部分時間在85%以上（圖3）；2：00—6：00的空氣相對濕度絕大部分在90%以上，葉面濕度在100%?？傮w上，監測點空氣相對濕度有利于稻瘟病病菌分生孢子的產生。而實際監測數據顯示，9月和10月孢子數量較少，說明空氣相對濕度符合的條件下，當年監測點稻瘟病菌孢子產生主要受氣溫的影響，這與稻瘟病菌生物學特性的研究結果相符合［10-11］。

降雨可以增加空氣相對濕度，有利于滿足稻瘟病菌孢子形成所需的高濕環境條件，但雨水的沖刷不利于孢子向空中傳播。本研究的數據顯示，降雨對稻瘟病菌孢子經由空氣傳播的影響與此相符（圖4）。6月7日至8月24日孢子集中釋放期間，降雨后往往伴隨著孢子的大量釋放，典型的如7月16日（孢子數量達到507.9個·m-3空氣）、8月5日（孢子數量達到523.8個·m-3空氣）和8月9日（孢子數量達到852.3個·m-3空氣），這3個日期之前均有連續2～3 d的降雨，而降雨當天孢子檢出量相對較少，甚至未有孢子檢出。

風力不僅影響稻瘟病菌分生孢子的機械脫落，也影響孢子在空氣中的傳播。本研究中監測點鄰近浙江省三門灣，受海洋氣候的影響，取樣時間內絕大部分日期最大瞬時風速在5 m·s-1以上（圖5），其有利于引起分生孢子的機械脫落和傳播［12］。8月5日和8月9日孢子大量釋放的時間，都伴隨有7 m·s-1以上的最大瞬時風速。

圖4 稻瘟病菌分生孢子數量與降雨量的動態變化Fig.4 Dynamic changes of rainfall and number of rice blast spore

圖5 稻瘟病菌分生孢子數量與最大風速的動態變化Fig.5 Dynamic changes of wind velocity and number of rice blast spore

3 結論與討論

監測空氣中稻瘟病菌分生孢子數量的動態變化，對于稻瘟病發生為害的預測預報及指導防治具有重要的現實意義。本研究利用 Su'udi等［7］設計的稻瘟病菌特異性Taqman探針，成功建立了1種稻瘟病菌分生孢子的定量方法，并應用其對稻田空氣中稻瘟病菌分生孢子數量進行了監測。Su'udi等［7］的方法可檢測出至少8個分生孢子的基因組DNA，本研究建立稻瘟病菌分生孢子定量標準曲線時，發現1.5×102個·mL-1的樣品未有擴增曲線，最低檢測限為2.4～24個分生孢子基因組DNA。總體上，本研究建立的稻瘟病菌分生孢子定量方法的靈敏度已足夠用于田間菌源量的動態監測。

對孢子田間捕捉樣品的定量分析發現，水稻生育期空氣中稻瘟病菌分生孢子數量波動幅度較大，稻瘟病菌分生孢子釋放集中在6月7日至8月24日，基本與這段時間溫、濕度條件比較適宜稻瘟病菌分生孢子產生和釋放有關［10］。寧海絕大部分時間風速較大，有利于孢子分散。據當地農業技術部門調查，附近鄉鎮當年種植的部分品種有葉瘟中度發生（個別品種重度發生）。早期的研究證明，稻瘟病菌株能夠侵染牛筋草、狗尾草、馬唐、稗、李氏禾、羅氏草和鋪地黍等禾本科雜草［13-14］，這些雜草在該稻區分布廣泛。采樣點鄰近水庫和溪流，多山地，6月7日至8月24日有利的溫、濕度條件使得稻瘟病菌在這些雜草上迅速繁殖。

田間稻瘟病的發生程度受菌源量、寄主抗性水平和氣象條件的共同決定。在明確品種抗性水平的前提下，利用本研究方法開展空氣中稻瘟病菌孢子數量的監測，結合氣象條件，及時預測預報是否有利于病害發生、發展和流行，能夠對病害及時進行防控。

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（責任編輯 侯春曉）

Development of a qPCR detection method for monitoring conidial density of rice blast fungus in the air

XU Liao-yuan1，ZHAO Li-wen1，HU Yu-feng2，QIU Hai-ping3，CHAI Rong-yao3，ZHANG Zhen3，*
（1.Ningbo Plant Cultivation Management Station，Ningbo 315012，China；2.Ninghai Agricultural Technology Extension and Service Center，Ninghai 315600，China；3.Institute of Plant Protection and Microbiology，Zhejiang A-cademy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

Rice blast disease，caused by Magnaporthe oryzae，was one of the most devastating fungal diseases of rice.It was very important to monitor airborne conidial density of M.oryzae in fields for forecasting and control of blast disease.In present study，a qPCR detection method for conidia of M.oryzae was developed，based on M. oryzae MHP1 gene as the target sequence.Airborne conidia of M.oryzae in fields were trapped and quantified using this method.The results showed that airborne conidia population of M.oryzae was largely fluctuant，and indicated that the conidia release of M.oryzae was obviously affected by meteorological conditions during the monitoring periods.Generally，this qPCR method could be used to detect and quantified airborne conidia of rice blast fungus in fields.

rice blast；amount of conidia；spore trap；qPCR；meteorological factor

S435.121.4+5

A

1004-1524（2016）08-1368-06

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.14

2016-04-11

國家公益性行業（農業）科研專項（201203014）；浙江省公益技術研究農業項目（2014C32018）

許燎原（1972—），男，浙江寧波人，高級農藝師，主要從事植物保護等研究。E-mail：ddd0574@126.com
*

，張震，E-mail：zzhangcn@126.com