草莓MYB類轉錄因子FaMYB5基因的克隆與表達分析

馮 琛，王 玲，湯浩茹，肖 婕（四川農業大學園藝學院，四川成都611130）

草莓MYB類轉錄因子FaMYB5基因的克隆與表達分析

馮 琛，王 玲，湯浩茹*，肖 婕
（四川農業大學園藝學院，四川成都611130）

以豐香草莓（Fragaria×ananassa cv.Toyonaka）為試材，通過同源克隆技術獲得FaMYB5基因全長編碼序列，運用生物學軟件對該序列進行相關生物信息學分析，同時采用實時熒光定量PCR方法對FaMYB5基因在果實不同發育階段的表達模式進行研究。FaMYB5基因的cDNA全長為822 bp，編碼273個氨基酸，蛋白質分子量為29.159 ku，等電點為5.709，與森林草莓的FvMYB5同源性達95.7%。實時熒光定量PCR分析顯示，隨著果實發育成熟，FaMYB5基因的表達逐漸上升。在果實的小綠期（SG），FaMYB5基因的表達量最低。但是在白果期（WT）出現1個降低的峰值，其表達量略高于小綠期，草莓果實開始轉紅時其表達量又逐漸上升，在果實全紅期（FR）達到最大。結果獲得了豐香草莓MYB類轉錄因子FaMYB5基因的cDNA全長，其表達存在差異。

草莓；FaMYB5；轉錄因子；基因克隆；表達模式

類黃酮化合物（flavonids）是植物重要的次生代謝產物之一，在植物界中分布廣泛且具有較強的生物活性，不僅有益于人類身體健康，還影響植物花器官發育和果實著色等。草莓屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實含高濃度的類黃酮化合物，具有重要的保健功能和顯著的經濟效益，倍受消費者和種植者的喜愛。目前，草莓類黃酮化合物代謝途徑中主要結構基因已被認知，但是有關該途徑轉錄調控信息的研究相對較少。

大量研究表明，類黃酮化合物花青素苷、原花青素等代謝途徑均受MYB轉錄因子調控。2008年Dubos等［1］和Matsui等［2］發現，AtMYBL2是類黃酮途徑的負調控因子，抑制種子中原花青素的合成和代謝。Gonzalez等［3］發現，AtMYB5 與AtTT8、AtTT2組成三元復合體，調節外種皮和毛狀體的形成，在種子原花青素合成途徑中起重要作用。Quattrocchio等［4］在矮牽牛中發現 At-MYB5的同源基因PbPH4與花瓣細胞和液泡的呈酸性有關；然而Deluc等［5］在葡萄中發現與 At-MYB5同源的VvMYB5a和VvMYB5b在葡萄漿果內的原花青素和花青素合成途徑均起著重要作用。

另外有研究表明，矮牽牛中的 R3-MYB、PHMYBx配合R2R3-MYB抑制劑PhMYB27，負調控PhPHZ-PhAN1-PhAN11 MBW復合物的活性，達到調節營養器官中花青素合成的目的［6］。在此基礎上，Aharoni等［7］推斷，在草莓果實中可能也存在相似的機制，FaMYB5可能與負調控因子FaMYB1結合，共同調節與原花青素或花青素合成有關的MBW復合體活性，而FaMYB1是抑制花青素相關基因的轉錄從而抑制花青素的合成。另外，Burr等［8］認為，由于 FabHLH3Δ和FaMYB5有相互作用，且都是在果實發育早期表達，FabHLH3Δ可能對FaMYB5起到抑制作用。2013年Schaart等［9］發現FaMYB5的轉錄產物量在草莓發育過程中很穩定，可以假定它在草莓發育早期原花青素合成途徑和成熟期花青素的合成途徑中都起到了重要作用。FaMYB5可能抑制草莓果實原花青素或花青素合成途徑（圖1），需要進一步研究。

為進一步探明FaMYB5在草莓中的表達特點，擬采用草莓栽培品種豐香為材料，克隆得到FaMYB5基因cDNA全長序列，采用生物信息學方法對其序列進行分析，并通過實時熒光定量PCR技術對FaMYB5基因的表達特點進行分析，為進一步實現對FaMYB5基因的功能研究提供科學依據。

圖1 草莓果實原花青素和花青素生物合成的轉錄調控途徑［9］Fig.1 Putative transcriptional regulatory pathways controlling PA and anthocyanin biosynthesis in strawberry fruit

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為草莓栽培品種豐香，購于四川省雙流縣興隆鎮草莓種植基地，于2012年9月10日移栽至人工氣候箱，培養條件為白天室溫25℃，夜間15℃，相對濕度70%～90%，光照16 h，處理到11月中上旬時，草莓開始逐漸坐果。分別采集草莓不同發育時期的果實樣品，樣品時期的劃分參照 Hou等［10-11］、Jia等［12］方法，（1）小綠期（small green，SG）：坐果后7 d左右；（2）大綠期（big green，BG）：坐果后14 d左右；（3）白果期（white，WT）：坐果20 d左右，果實個體已經轉白，部分種子已經著色；（4）始紅期（initially red，IR）：坐果23 d左右，果實向光面有小于1/2的面積轉紅；（5）片紅期（partially red，PR）：坐果25 d左右，果實向光面大于1/2的面積轉紅；（6）全紅期（full red，FR）：坐果28 d左右，果實全紅。各時期材料用液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 FaMYB5基因的克隆

參照Chen等［13］的改良CTAB法，提取草莓果實總RNA，并用DNA酶Ⅰ（Thermo）處理以消除基因組DNA后參照反轉錄試劑盒（Thermo）進行第一鏈cDNA的合成，然后-20℃保存待用。對GenBank中登錄的擬南芥MYB5（NP187963.1）、蘋果MYB12a （AHM88213.1）、李屬MYB5（XP008220661.1）、葡萄MYB5a（AAS68190）、葡萄 MYB5b（AAX51291）等MYB5基因進行保守序列分析，并以此為探針在薔薇科基因組數據庫（Genome Database for Rosaceae）中找到森林草莓的同源基因，利用Primer 5.0軟件設計一對克隆cDNA全長的特異引物FaMYB5-F和FaMYB5-R（表1）。PCR擴增采用20 μL反應體系，其中上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix（天根，北京）10 μL，ddH2O補足到20 μL。擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性40 s；57℃退火30 s；72℃延伸1 min；35個循環；72℃再延伸10 min。PCR產物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物，上海）回收后連接到pMD19-T（寶生物，大連）載體上，轉化大腸埃希菌JM109（本實驗室保存），將篩選出的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。結合NCBI核酸及蛋白數據庫進行Blast搜索，判斷是否成功克隆到相應的同源基因。

1.2.2 FaMYB5的相關生物信息學分析

利用 NCBI Blastn/p、DNAMAN、HMMER、ClustalX、MEGA 5.0、SignalP 4.1、SMART、Inter-ProScan、DNAstar等生物軟件進行氨基酸同源性比對［14］，蛋白質分子量、等電點、跨膜區及信號肽預測，蛋白質亞細胞定位預測，以及基于氨基酸序列的系統進化樹的構建。另外，通過SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）同源建模，以V-MYB晶體光衍射結構為模板，構建了FaMYB5的三級結構域模型。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析

根據獲得的FaMYB5的全長cDNA序列，利用Beacon Designer 7在該基因3'末端的非保守結構域設計實時熒光定量PCR引物FaMYB5-1 和FaMYB5-2（表1）。熒光染料選擇SYBR（寶生物，大連），使用 CFX96實時定量PCR儀（Bio-Rad，美國）對果實6個不同的發育時期（小綠、大綠、白果、始紅、片紅、全紅）的表達量進行測定。熒光定量PCR采用20 μL體系，其中包括SYBR Green熒光染料10 μL，上下游引物各0.6 μL，稀釋10倍的cDNA 2 μL，用已滅菌的ddH2O補足至20 μL。擴增程序為95℃預變性5 s；95℃變性5 s，退火溫度為55℃，最后72℃延伸30 s，共40個循環。每次循環在退火延伸結束后進行熒光采集。最后95℃保溫15 s，降溫到60℃維持30 s，65℃開始以0.5℃每步升溫，并維持5 s采集熒光信號至95℃結束反應，繪制熔解曲線。以不加模板cDNA為陰性對照，4孔重復，以全紅時期果實為對照，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

以草莓FaActin-7-like（XM_004306544.1）基因作為熒光定量PCR內參照，設計引物為FaActin-F和FaActin-R（表1），PCR反應體系和程序同FaMYB5。

表1 試驗所用引物Table 1 Sequence of primers

2 結果與分析

2.1 FaMYB5的全長編碼區克隆

以反轉錄合成的cDNA為模板，利用特異引物FaMYB5-F和FaMYB5-R進行基因完整編碼區的擴增，產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，在800 bp左右有一條明亮且單一的條帶，與預測片段大小相符（圖2）。對該片段進行回收、連接、轉化、提取質粒以及質粒PCR鑒定得到陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果顯示，該cDNA全長822 bp，與森林草莓FvMYB5同源性達95.7%（圖3），較FvMYB5多了一段串聯重復，導致氨基酸序列差異，且該差異序列不在MYB家族保守結構區域中，所以FaMYB5蛋白結構并未發生改變，這可能是由于品種不同造成的差異。通過 NCBI Blastn在線比對，與其GenBank中登錄的擬南芥MYB5（NP187963.1）、蘋果 MYB12a（AHM88213.1）、李屬 MYB5 （XP008220661.1）、葡萄MYB5a（AAS68190）、葡萄MYB5b（AAX51291）等其他物種MYB5基因的同源性比對，結果顯示同源性均不高，約為50%。

圖2 FaMYB5 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.2 　Amplification of full open reading frame of FaMYB5 using cDNA

圖3 FaMYB5與FvMYB5核酸序列比對Fig.3 The aligment of FaMYB5 gene with FvMYB5

2.2 FaMYB5的相關生物信息學

采用 SMART和 InterProScan軟件分析，FaMYB5的第5～59個氨基酸為MYB結構域。FaMYB5轉錄因子蛋白特性分析通過在線蛋白質分析工具（http：//isoelectric.ovh.org）進行，結果顯示，FaMYB5轉錄因子編碼273個氨基酸，蛋白質分子量約為 29.159 ku，正電荷氨基酸占10.99%，負電荷氨基酸占10.26%，理論等電點為5.709。用信號肽預測在線分析工具SignalP 4.1對草莓FaMYB5轉錄因子蛋白進行信號肽分析，結果顯示，FaMYB5蛋白是水溶性蛋白，不含信號肽。運用Protfun在線軟件進行蛋白功能預測，結果顯示，FaMYB5轉錄因子具有調控功能（表2）。

草莓FaMYB5轉錄因子的二級結構預測用DNAStar分析軟件中的Protein進行，根據Chou-Fasman的經驗參數法，發現FaMYB5蛋白的α-螺旋結構有9個，β折疊區結構有6個，β-轉角結構有27個（圖4）。氨基酸親水性分析顯示，FaMYB5蛋白的大多數氨基酸為親水性氨基酸（圖4）。

將推導出的氨基酸序列通過ESPript 3.0進行同源建模分析其結構特征。從圖5可以看出，R2R3類MYB轉錄因子具有2個DNA結合結構域R2和R3，而FaMYB5轉錄因子N端缺失70個氨基酸導致R2結構域缺少，只含1個R結構域。同時也可看到每1個R結構域都含有51～52個保守的氨基酸殘基和間隔序列構成，并且每隔約18個氨基酸就會規則的出現1個色氨酸殘基（w），從二級結構圖上還可以看到這些氨基酸殘基構成3個α螺旋。另外R3的前2個螺旋存在1個與bHLH的交互作用有關的保守區域［DE］Lx2［RK］x3Lx6Lx3R。因此，從二級結構上判斷，草莓FaMYB5更類似R3類MYB轉錄因子，這與Schaart等［9］的研究結果一致。

表2 FaMYB5蛋白功能預測Table 2 Function prediction of FaMYB5 protein

對已報道的MYB5轉錄因子及文獻來源的與FaMYB5功能相近的MYB轉錄因子氨基酸序列，用MEGA 5.0［15］軟件構建系統進化樹。圖6進化樹表明，草莓與李屬和蘋果屬聚為一類，說明他們的進化關系較近，推測草莓與李屬和蘋果在進化過程中，具有某些相似的生理特征和形態特征。

利用I-TASSER（http：//zhanglab.ccmb.med. umich.edu/I-TASSER/）同源建模，以V-MYB晶體光衍射結構為模板，構建了FaMYB5的3級結構模型（圖7）。由圖7可以看出，FaMYB5轉錄因子含有3個α螺旋，構成1個R結構域，該結構域折疊成HTH結構。由FaMYB5的三級結構示意圖可以進一步推斷該轉錄因子屬于R3類MYB轉錄因子。

圖4 草莓FaMYB5轉錄因子二級結構預測Fig.4 Prediction of FaMYB5 transcription factor secondary structure of strawberry

圖5 FaMYB5轉錄因子比對的R2R3結構域示意圖Fig.5 Alignment of FaMYB5 transcription factors，indicating the R2R3 domain of the deduced amino acids

2.3 FaMYB5基因在草莓果實發育過程中的表達

草莓果實發育中經歷幾個明顯的果實轉色過程，幼果的綠色到白色，最后轉紅進入成熟。由由圖8可以看出，FaMYB5基因在草莓果實發育的6個時期均有表達，其表達量的大小存在差異。從整體趨勢看，隨著果實發育成熟，FaMYB5基因的表達是逐漸上升的。在果實的小綠期（SG），FaMYB5基因的表達量最低。但是在白果期（WT）出現一個降低的峰值，其表達量略高于小綠期，之后草莓果實開始轉紅時其表達量又逐漸上升，在果實全紅期（FR）達到最大。FaMYB5基因的相對表達量分別為 0.20、0.54、0.24、 0.65、0.85、1.00。

圖6 MYB轉錄因子氨基酸序列系統進化樹Fig.6 Phylogenitic relationships between flavonoid-related MYBs

圖7 FaMYB5三級結構示意圖及球棍模型Fig.7 3D structures and ball and stick model of FaMYB5 protein

3 討論

DNA結合域是MYB類轉錄因子結構中最為保守的區域，一般由1～3個不完全重復序列（R）組成，每1個R結構域含有51～52個保守的氨基酸殘基及間隔序列，而且每隔18個氨基酸就會規則的出現1個色氨酸殘基（w），這些氨基酸殘基構成3個α螺旋［16］。這些保守序列對MYB類轉錄因子基因的克隆和鑒定具有指導意義。

在本研究中，通過生物信息學分析可知，FaMYB5轉錄因子只有1個R結合域，其與靶DNA的結合可能會受到影響。但由于FaMYB5屬于R3類轉錄因子，其R3結構域的前2個螺旋包含1個保守區域［DE］Lx2［RK］x3Lx6Lx3R，具有與bHLH交互作用的結構基礎，另外，酵母雙雜交證實FaMYB5與bHLH3和bHLH3Δ有交互作用［9］。因此，可推斷轉錄因子FaMYB5可能通過與R2R3類轉錄因子競爭bHLH轉錄因子的結合位點，間接調控相關酶基因。Schaart等［9］推測，草莓中FaMYB5可能與其他植物來源的R3 類MYB因子有相似功能，對類黃酮代謝途徑起負調控作用，但其功能和調控機制仍不明確，需要進一步的研究。

從果實發育過程中的表達情況可以看出，該基因在草莓發育的整個過程中表達量有一定差異，后期的表達量相對前期較高，有報道指出不同品種的草莓FaMYB5基因在果實不同發育時期表達模式不同［9］，本研究發現，草莓豐香的FaMYB5表達模式與Elsanta和Sonata品種草莓較相似。FaMYB5是否是類黃酮化合物代謝途徑中的負調控因子，及其調控機制有待進一步研究。

本研究采用同源克隆技術，獲得豐香草莓MYB類轉錄因子FaMYB5基因的cDNA全長，通過實時熒光定量PCR分析，在果實發育過程中，FaMYB5基因的表達存在差異，為進一步實現對這個基因的表達調控提供了基礎資料。

圖8 FaMYB5基因在草莓果實發育過程中的表達模式Fig.8 　Expression patterns of FaMYB5 in strawberry fruit development

（References）：

［1］ DUBOS C，LE GOURRIEREC J，BAUDRY A，et al.MYBL2 is a new regulator of flavonoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal for Cell&Molecular Biology，2008，55（6）：940-953.

［2］ MATSUI K，UMEMURA Y，OHME-TAKAGI M.AtMYBL2，a protein with a single MYB domain，acts as a negative regulator of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis［J］.Plant Journal，2008，55（6）：954-967.

［3］ GONZALEZ A，MENDENHALL J，HUO Y J，et al.TTG1 complex MYBs，MYB5 and TT2，control outer seed coat differentiation［J］.Developmental Biology，2009，325（2）：412 -421.

［4］ QUATTROCCHIO F，VERWEIJ W，KROON A，et al.PH4 of Petunia is an R2R3 MYB protein that activates vacuolar acidification through interactions withbasic-helix-loop-helix transcription factors of the anthocyanin pathway［J］.Plant Cell，2006，18（5）：1274-1291.

［5］ DELUC L，BOGS J，WALKER A R，et al.The transcription factor VvMYB5b contributes to the regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in developing grape berries ［J］.Plant Physiology，2008，147（4）：2041-2053.

［6］ ALBERT N W，LEWIS D H，ZHANG H，et al.Members of an R2R3-MYB transcription factor family in Petunia are developmentally and environmentally regulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning［J］.Plant Journal for Cell&Molecular Biology，2011，65（5）：771-784.

［7］ AHARONI A，DEVOS C H，WEIN M，et al.The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco［J］.Plant Journal，2001，28（3）：319-332.

［8］ BURR F A，BURR B，SCHEFFLER B E，et al.The maize repressor-like gene intensifier1 shares homology with the r1/b1 multigene family of transcription factors and exhibits missplicing［J］.Plant Cell，1996，8（8）：1249-1259.

［9］ SCHAART J G，DUBOS C，ROMERO DE LA FUENTE I，et al.Identification and characterization of MYB-bHLH-WD40 regulatory complexes controlling proanthocyanidin biosynthesis in strawberry（Fragaria×ananassa）fruits［J］.New Phytologist，2013，197（2）：454-467.

［10］ HOU Y X，TANG H R，ZHANG Y，et al.Cloning and expression analysis of ascorbate peroxidase gene during fruit development and ripening in Fragaria×ananassa cv.Toyonaka［J］.World Journal of Agricultural Sciences，2009，5（6）：675-679.

［11］ 侯艷霞.草莓抗壞血酸代謝相關酶基因apx和dhar的克隆、序列分析及其表達模式研究［D］.雅安：四川農業大學，2010：82-83. HOU Y X.Molecular cloning，sequence analysis，and expression of apx and dhar gene involed in Fragaria×Ananassa ascorbic acid metabolism［D］.Ya'an：Sichuan Agricultural University，2010：82-83.（in Chinese with English abstract）

［12］ JIA H F，DONG L，SUN J H，et al.Type 2C protein phosphatase ABI1 is a negative regulator of strawberry fruit ripening［J］.Journal of Experimental Botany，2013，64（6）：1677-1687.

［13］ CHEN Q，YU H W，WANG X R，et al.An alternative cetyltrimethyl ammonium bromide-based protocol for RNA isolation from blackberry（Rubus L.）［J］.Genetics and Molecular Research，2012，11（2）：1773-1782.

［14］ 付曉偉，焦健，劉崇懷，等.山葡萄及其雜種Myb相關基因的基因型及 VvmybA1片段的分析［J］.果樹學報，2014，31（3）：353-361. FU X W，JIAO J，LIU C H，et al.Genotyping Myb-related genes in Vitis amurensis and its hybrids and characterizing the VvmybA1 fragment sequences［J］.Journal of Fruit Science，2014，31（3）：353-361.（in Chinese with English abstract）

［15］ TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood evolutionary distance and maximum parsimony methods ［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731 -2739.

［16］ FRAMPTON J.Myb transcription factors：Their role in growth，differentiation and disease［M］.Netherlands：Springer，2004.

（責任編輯 張 韻）

Cloning and expression analysis of MYB transcription factor FaMYB5 gene from strawberry

FENG Chen，WANG Ling，TANG Hao-ru*，XIAO Jie
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

The full-length cDNA sequence of FaMYB5 gene was cloned from strawberry（Fragaria×ananassa cv. Toyonaka）through homology cloning method.Then，bioinformatics and expression pattern of FaMYB5 were analyzed by some softwares and real-time fluorescent quantitative PCR technique，respectively.Sequence analysis showed that the cDNA of FaMYB5 was 822 bp，encoding 273 amino acids，while the estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 29.159 ku and 5.709，and shared high identity of 95.7%with FvMYB5 from woodland strawberry.The expression analysis showed that the expression level of FaMYB5 was gradually increasing during fruit development.The lowest expression was detected at small green（SG）stage，and a reduced peak appeared at white stage，when the expression level was merely higher than SG stage.Thereafter，the expression increased gradually from initially red（IR）stage to the full red（FR）stage when the highest level was detected.In short，full-length cDNA of FaMYB5 was cloned from strawberry，and the expression levels were different during fruit development.

strawberry；FaMYB5；transcription factor；gene cloning；expression pattern

S668.4

A

1004-1524（2016）08-1351-09

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.12

2016-01-25

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20125103110005）

馮琛（1992—），男，河北邢臺人，碩士，從事分子生物學在果樹上的應用研究。E-mail：fengchensicau@163.com
*

，湯浩茹，E-mail：htang@sicau.edu.cn