碳源對多粘類芽孢桿菌生長和多粘菌素E合成的影響

孫仲奇，裘娟萍，陸建衛(wèi)，趙春田，*（.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州3004；.浙江錢江生物化學股份有限公司，浙江海寧34400）

碳源對多粘類芽孢桿菌生長和多粘菌素E合成的影響

孫仲奇1，裘娟萍1，陸建衛(wèi)2，趙春田1，*
（1.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014；2.浙江錢江生物化學股份有限公司，浙江海寧314400）

為探究提高多粘菌素E產量的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉，應用平板菌落計數和HPLC法研究了其對多粘類芽孢桿菌生長和多粘菌素E產量的影響。結果表明，5種碳源對多粘類芽孢桿菌的生長和多粘菌素E產量的影響不同，可溶性淀粉是菌體生長的最適碳源，且多粘菌素E產量依次為可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖。可溶性淀粉有助于延長多粘菌素E的產素期和提高其合成速率，與葡萄糖作碳源相比，多粘菌素E的產量和合成速率分別提高了111%和60%。因此，可溶性淀粉是多粘菌素E合成的最適碳源。

多粘類芽孢桿菌；多粘菌素E；碳源；可溶性淀粉

多粘菌素E（polymyxin E）是一種由多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）產生的多肽類抗生素［1］，主要通過破壞細胞膜的通透性［2］和誘導胞內羥基自由基的產生［3］，使菌體死亡。因其抗畜禽革蘭氏陰性菌作用強、毒性小、安全性高、消化道不易吸收、藥物殘留低，常用于飼料添加劑，是一種安全的促生長類抗生素［4-5］。

多粘菌素E由Dab、Thr、Leu和疏水酰基尾組成，通過多粘菌素合成酶PmxA、PmxB和PmxE經非核糖體途徑合成，再經過轉運蛋白PmxC和PmxD將其運輸到細胞外［6］。多粘菌素E前體氨基酸Dab由ectB基因編碼的二氨基丁酸氨基轉移酶（diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase，EctB）催化L-Asp合成［7-9］。其前體氨基酸由機體通過初級代謝途徑合成［10］，且非核糖體合成途徑中氨基酸的延伸需要消耗大量的ATP［11］，因此，適宜的碳源對多粘菌素E的高產至關重要。葡萄糖是多種抗生素合成過程中較好的碳源和能源，但是其分解代謝阻遏效應（carbon catabolite repression，CCR）會抑制多種抗生素的合成，例如青霉素、頭孢菌素等［11］，而一些非速效碳源可以促進抗生素的生物合成，如植物油可以促進頭孢菌素和紅霉素的產生［12-13］，淀粉可以促進阿維菌素和普那霉素的合成［14-15］。因此，篩選有利于抗生素合成的碳源就顯得非常重要。本研究通過分析不同碳源對多粘菌素E發(fā)酵過程中pH值、殘?zhí)呛投嗾尘谽產量等參數的影響，篩選出最佳的碳源，為進一步提高多粘菌素E產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株來源

多粘類芽孢桿菌由浙江工業(yè)大學微生物研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏10.0，蛋白胨15.0，葡萄糖10.0，酵母粉2.0，氯化鈉3.0，Fe-SO4·7H2O 0.1，瓊脂20.0，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基［16］，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基［16］，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有45 g· L-1葡萄糖（對照組），其他試驗組分別含有45 g· L-1的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與試劑

LC-20AD島津液相色譜儀（日本島津公司），PB-10 pH計（德國Sartorius公司），ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）。葡萄糖、蔗糖（廣東光華化學廠有限公司），麥芽糖、乳糖（上海伯奧生物科技有限公司），可溶性淀粉（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 菌株培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：將多粘類芽孢桿菌單菌落接種于新鮮斜面，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1級種子培養(yǎng)：將多粘類芽孢桿菌新鮮的斜面菌種接種于裝液量50 mL/250 mL三角瓶的1級種子培養(yǎng)基中，搖床轉速200 r·min-1，30℃培養(yǎng)24 h。

2級種子培養(yǎng)：將1級種子液以10%接種量接種于裝液量100 mL/500 mL三角瓶的2級種子培養(yǎng)基中，搖床轉速 200 r·min-1，30℃培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：按10%接種量將2級種子培養(yǎng)液接種于裝液量50 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉速 200 r·min-1，30℃培養(yǎng)96 h。

1.4 試驗設計及測定方法

試驗共設蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉4個處理，以葡萄糖為對照組，每個處理重復3次，發(fā)酵期間每12 h取樣測定其pH、還原糖、總糖、生物量和多粘菌素E效價等參數。還原糖和總糖含量測定采用 3，5-二硝基苯酚法（DNS法）［17-18］；pH測定采用 PB-10 pH計測定；生物量測定采用平板計數法［19］；多粘菌素E效價的測定采用HPLC法［20］。

1.5 數據處理

利用Excel和Statview統(tǒng)計軟件進行數據分析和差異顯著度分析，數據處理后用Origin 8.0繪圖。

1.5.1 多粘菌素E相對效價的計算

根據公式（1）和（2）計算多粘菌素E的效價和相對效價。

式（1）中：Y為發(fā)酵液多粘菌素E效價（U· mL-1）；X為液相圖譜峰面積；B為稀釋倍數；0.004 52和1 723.761 13分別表示多粘菌素E標準曲線的x斜率和y軸截距；此標準曲線由實驗室以多粘菌素E硫酸鹽標準樣品的水溶液制作。

式（2）中：YT為T時刻各取樣點發(fā)酵液樣品多粘菌素E的效價（U·mL-1）；YEP為葡萄糖對照組發(fā)酵終點時多粘菌素E的效價（U·mL-1）；YR為多粘菌素E的相對效價（%）。

1.5.2 單位菌體多粘菌素E相對效價的計算

根據公式（3）和（4）計算單位菌體多粘菌素E的相對效價YPR（%），用于表征碳源對多粘菌素E合成能力的影響。

式（3）中：YP為發(fā)酵終點各組的效價（U· mL-1）；Bmax為發(fā)酵過程菌體生物量的最大值（106cfu·mL-1），以106cfu為1個菌體單位；YPB為各組發(fā)酵終點的效價與最大菌體生物量的比值（U·106cfu-1）。

式（4）中：YPB為試驗組發(fā)酵終點的效價與最大菌體生物量的比值（U·106cfu-1）；YPG為對照組發(fā)酵終點的效價與最大菌體生物量的比值（U· 106cfu-1）；YPR則為單位菌體多粘菌素E的相對效價（%）。

1.5.3 多粘菌素E相對合成速率的計算

由公式（5）和公式（6）分別計算試驗組和對照組各個時間段多粘菌素 E的合成速率（U· mL-1·h-1）和相對合成速率（%），用于表征碳源對多粘菌素E合成速率的影響。

式（5）中：YRn-YRr為各組單位體積發(fā)酵液中每12 h合成的多粘菌素E的量（U·mL-1）；YS為每h多粘菌素 E的平均合成速率（U·mL-1· h-1）。

式（6）中：YSCM為試驗組多粘菌素E的最大合成速率（U·mL-1·h-1）；YSGM為葡萄糖對照組多粘菌素E的最大合成速率（U·mL-1·h-1）；YSR為多粘菌素E的相對合成速率（%）。

1.5.4 碳源轉化為多粘菌素E相對轉化率的計算

根據公式（7）和（8）計算碳源的相對轉化率

式（7）中：C為碳源轉化為多粘菌素E的轉化率（U·g-1）；MS-MF為單位體積發(fā)酵液中碳源的消耗量，即初始培養(yǎng)基添加量與發(fā)酵結束后培養(yǎng)基殘留量的差值（g·L-1）；YF為發(fā)酵終點多粘菌素E的效價（U·L-1）。

式（8）中：CR為碳源轉化為多粘菌素E的相對轉化率（%）；CSM為發(fā)酵過程中試驗組碳源轉化為多粘菌素E的轉化率（U·g-1）；CGM為發(fā)酵過程中對照組葡萄糖轉化為多粘菌素E的轉化率（U·g-1）。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄糖質量濃度對多粘類芽孢桿菌生長的影響

將相同含量的多粘類芽孢桿菌接入不同質量濃度葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)22 h，取樣，測定D600，結果如圖1所示。培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度小于20 g·L-1有利于多粘類芽孢桿菌的生長，當葡萄糖濃度達到20 g·L-1時，液體培養(yǎng)基中菌體含量達到最大值。葡萄糖濃度大于20 g·L-1會抑制多粘類芽孢桿菌的生長，葡萄糖質量濃度越高，菌體生長受抑制程度越嚴重。當葡萄糖濃度為50 g·L-1時，其最大菌體含量僅為以20 g·L-1葡萄糖最大菌體含量的64%。表明一定濃度的葡萄糖促進多粘類芽孢桿菌的生長，而高濃度的葡萄糖則會抑制多粘類芽孢桿菌的生長。

圖1 不同葡萄糖質量濃度下多粘類芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 The growth curve of Paenibacillus polymyxa in different concentrations of glucose

2.2 碳源對多粘類芽孢桿菌生長的影響

將多粘類芽孢桿菌按照1.3節(jié)的方法進行培養(yǎng)，由圖2可知，不同碳源培養(yǎng)基中多粘類芽孢桿菌的生長趨勢相似。在發(fā)酵0—12 h，葡萄糖對照組多粘類芽孢桿菌開始快速生長，但此時的菌體含量相對最少，之后菌體開始快速生長，在36 h生物量最先達到最高值，可能葡萄糖作為速效碳源被菌體迅速利用，從而促進菌體生長；發(fā)酵36 h后菌體開始進入衰亡期，多粘類芽孢的生長受到抑制。在蔗糖、乳糖和麥芽糖試驗組中，發(fā)酵48 h內菌體處于快速生長期，之后菌體開始進入衰亡期。而在可溶性淀粉試驗組中，發(fā)酵0—60 h，多粘類芽孢桿菌處于快速生長期，至60 h菌體量達到最大，可能因為可溶性淀粉的利用需要菌體合成的淀粉酶將其分解為葡萄糖才能進入同化途徑供給菌體生長，有一定的生長延遲現象。5組試驗組中，可溶性淀粉試驗組的生物量最后達到最高。

2.3 碳源對多粘菌素發(fā)酵過程中pH值、還原糖、總糖含量的影響

圖2 多粘菌素E發(fā)酵過程中碳源對多粘類芽孢桿菌生長的影響Fig.2 　Influence of carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa during polymyxin E fermentation

培養(yǎng)基pH值是菌體生長代謝的重要表征，對抗生素的合成至關重要［21］。由圖3-A可知，各試驗組發(fā)酵過程中，pH變化趨勢基本相同，由于碳源的快速消耗，pH值呈現下降趨勢；發(fā)酵36 h后，不同碳源引起的pH值差異趨于明顯，其中，葡萄糖對照組pH呈現最高值，而可溶性淀粉試驗組的pH值維持在最低水平。從圖3-B和3-C可知，在發(fā)酵過程中，各試驗組對糖的利用趨勢相似；發(fā)酵開始后，各試驗組還原糖含量迅速下降，發(fā)酵48 h后葡萄糖對照組的還原糖含量不再變化，維持在最高水平，而可溶性淀粉試驗組的還原糖含量維持在最低水平；各試驗組的總糖含量基本維持在相同水平。

圖3 碳源對多粘菌素E發(fā)酵過程中pH值、還原糖和總糖的影響Fig.3 Influence of carbon sources on pH，reducing sugar and total sugar during polymyxin E fermentation

2.4 碳源對多粘菌素E產量及其合成速率的影響

從圖4-A可見，不同碳源對多粘菌素E產量的影響不同，其最終效價依次為可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖。其中，可溶性淀粉和乳糖試驗組的多粘菌素E合成能力高于其他組，其最終相對效價分別是以葡萄糖對照組的2.11和1.58倍。可溶性淀粉試驗組中，多粘類芽孢桿菌在12 h開始合成多粘菌素E，葡萄糖對照組和其他試驗組在24 h才開始合成多粘菌素E。對比圖3-B和圖3-C，推測高濃度的葡萄糖不利于多粘菌素E的合成，而可溶性淀粉試驗組中淀粉酶的緩慢釋放所產生低濃度的還原糖沒有葡萄糖效應，有利于多粘菌素E的生物合成。從圖4-B多粘菌素E合成速率可知，不同試驗組中多粘菌素E的合成速率趨勢相似，均在36～48 h達到最大合成速率，之后開始下降。發(fā)酵84 h之后，葡萄糖對照組、蔗糖試驗組和麥芽糖試驗組的合成速率降為0，而乳糖試驗組和可溶性淀粉試驗組依然可以維持一定的合成速率。葡萄糖對照組合成速率最高值相對最低，乳糖試驗組和可溶性淀粉試驗組的相對合成速率最大，分別比葡萄糖對照組高51%和60%，說明非速效碳源——乳糖和可溶性淀粉可以提高多粘菌素E的合成速率，同時相對延長合成時間，從而提高多粘菌素E的產量。

圖4 碳源對多粘菌素E相對效價及相對合成速率的影響Fig.4 Influence of carbon sources on relative polymyxin E production and relative synthetic rate of polymyxin E

2.5 碳源對單位菌體多粘菌素E產量的影響

多粘菌素E是在細胞內合成的，其合成與細胞的生長有一定的相關性。根據1.5.2節(jié)公式（3）和（4）計算單位菌體的多粘菌素E產量，橫坐標表示不同碳源的試驗組別，結果見圖5。可溶性淀粉試驗組中單位菌體合成多粘菌素E的能力最強，乳糖試驗組次之，葡萄糖對照組最低，推測乳糖和可溶性淀粉可以調節(jié)多粘類芽孢桿菌的次級代謝，促進多粘菌素E的生物合成。

2.6 碳源轉化為多粘菌素E的差異

根據1.5.4節(jié)方法計算不同碳源的相對轉化率，結果如圖6所示。在發(fā)酵過程中不同碳源的多粘菌素E轉化效率不同。在各試驗組中，可溶性淀粉—多粘菌素E的相對轉化率最高，乳糖—多粘菌素E的相對轉化率次之，葡萄糖—多粘菌素E的相對轉化效率最低。由此可知，可溶性淀粉更有利多粘類芽孢桿菌合成多粘菌素E。2.7 不同碳源對多粘類芽孢桿菌合成多粘菌素的影響

圖5 碳源對單位菌體多粘菌素E產量的影響Fig.5 Influence of carbon sources on the polymyxin E production per unit biomass

圖6 碳源轉化為多粘菌素E的相對效率Fig.6 　The relative conversion efficiency of carbon sources to the polymyxin E production

由上述試驗結果可知，多粘類芽孢桿菌在不同碳源條件下進行發(fā)酵，其合成多粘菌素E的結果不同，將其主要發(fā)酵參數進行匯總，結果見表1。由表1可知，各試驗組消耗的碳源無明顯差別，最大生物量相近，但是多粘菌素E相對效價相差較大，其中，以可溶性淀粉為碳源的試驗組相對效價最高、合成速率最快、單位菌體合成能力最強，其最大值分別為葡萄糖對照組的211%、160%和197%。上述結果表明，多粘類芽孢桿菌利用可溶性淀粉轉化為多粘菌素E的效率高，合成速率快，使單位菌體合成多粘菌素E的能力增強，因此，可溶性淀粉是多粘菌素E生物合成的最適碳源。

表1 不同碳源培養(yǎng)基中多粘類芽孢桿菌合成多粘菌素E的比較Table 1 The comparison of the synthesis of polymyxin E by Paenibacillus polymyxa in the culture medium containing different carbon sources

3 討論

多粘菌素E作為動物飼養(yǎng)促長藥物，主要用于治療革蘭氏陰性菌（尤其是耐藥性革蘭氏陰性菌）引起的感染，抗菌作用強，飼養(yǎng)效果好，未來市場需求極大［4］，但是發(fā)酵過程中容易出現碳代謝阻遏效應［22］，導致多粘菌素E產量較低。

在抗生素發(fā)酵過程中，葡萄糖是廣泛應用的能源和碳源，能被菌體快速利用，維持菌體生長和初級代謝，為次級代謝產物的合成提供前體，但是高濃度的葡萄糖會通過碳阻遏效應抑制抗生素合成相關基因轉錄和相關酶的活性，從而抑制抗生素的合成［11，22］。而淀粉作為非速效碳源，能夠避免葡萄糖引起的碳阻遏效應，保障菌體的生長和次級代謝產物的合成。陳小煌等［23］發(fā)現可溶性淀粉對多粘類芽孢桿菌的生長優(yōu)于葡萄糖，陶銀英［24］的研究表明，可溶性淀粉對多粘菌素E的促進作用優(yōu)于葡萄糖，本研究結論與此一致。

多粘菌素E作為一種多肽類抗生素，其前體氨基酸通過TCA循環(huán)和氨基酸合成途徑合成。因此，菌體初級代謝強度與多粘菌素E產量有一定的相關性。發(fā)酵過程pH結果表明，可溶性淀粉試驗組菌體初級代謝過程較強，能產生較多的副產物有機酸，使pH下降（圖3），而在葡萄糖對照組中，初始葡萄糖質量濃度高，導致發(fā)酵中后期菌體自溶過早（圖2），pH較高（圖3），使菌體初級代謝和次級代謝異常，多粘菌素E產量較低。同時，劉鐵軍等［25］對多肽類抗生素桿菌肽的發(fā)酵研究表明，適宜的葡萄糖質量濃度有利于避免碳阻遏效應，維持初級代謝和次級代謝相對平衡，提高抗生素產量。由此可知，在可溶性淀粉試驗組中，多粘類芽孢桿菌能夠分解可溶性淀粉維持一定量的葡萄糖質量濃度，可以平衡發(fā)酵過程中初級代謝和次級代謝強度，既能為菌體生長提供必需的前提也能為多粘菌素E的合成提供前提氨基酸。

此外，研究發(fā)現，在多粘菌素E的生物合成中，多糖聚合物可溶性淀粉高于蔗糖和葡萄糖，其可溶性淀粉試驗組中，較低濃度的葡萄糖能夠避免碳阻遏效應，維持菌體良好的生長狀態(tài)。同時，對發(fā)酵過程中多粘菌素E效價、合成速率以及相對轉化效率的研究發(fā)現，可溶性淀粉能夠提高多粘菌素E的合成速率，延長產素期，維持較高的轉化率，從而使多粘菌素E的產量提高，是合成多粘菌素E較為理想的非速效碳源。

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（責任編輯 侯春曉）

Effect of carbon sources on growth of Paenibacillus polymyxa and polymyxin E synthesis

SUN Zhong-qi1，QIU Juan-ping1，LU Jian-wei2，ZHAO Chun-tian1，*
（1.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Qianjiang Biochemical Co.，Ltd，Haining 314400，China）

In order to explore new methods to improve the yield of polymyxin E，five different carbon sources including glucose，sucrose，maltose，lactose and soluble starch were added in the fermentation medium，respectively. The influence on Paenibacillus polymyxa growth and polymyxin E production of different carbon sources were investigated through plate counting method and HPLC method.The results indicated that the effects of different carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa and the polymyxin E production varied significantly.The effect of these carbon sources on polymyxin E production was：soluble starch＞lactose＞sucrose＞maltose＞glucose.Soluble starch promoted both cell growth and polymyxin E yield by extending the polymyxin E biosynthetic period and promoting the synthetic rate.Compared with glucose as carbon source，the yield and the synthetic rate of polymyxin E were increased by 111%and 60%，respectively.Therefore，soluble starch was the optimal candidate for carbon sources among the five carbohydrates in polymyxin E synthese.

Paenibacillus polymyxa；polymyxin E；carbon source；soluble starch

S859.79；Q939.9

A

1004-1524（2016）08-1343-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.11

2015-12-08

浙江省生物工程重中之重學科開放基金項目（20130103）；浙江省自然科學基金項目（Y2111182）

孫仲奇（1990—），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mail：570987494@qq.com
*

，趙春田，E-mail：zct2008@yahoo.com