牦牛CAPN1基因intron 1多態(tài)性及其與胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性

陳 杰，田知利，胡 江，*，羅玉柱，劉 秀，王繼卿，石紅梅2，雷俊杰2（.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；2.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅 合作，747000）

牦牛CAPN1基因intron 1多態(tài)性及其與胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性

陳 杰1，田知利1，胡 江1，*，羅玉柱1，劉 秀1，王繼卿1，石紅梅2，雷俊杰2
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；2.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅 合作，747000）

采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)甘南牦牛、天祝白牦牛及大通牦牛鈣蛋白酶1（CAPN1）基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并分析SNPs對(duì)甘南牦牛部分胴體及肉質(zhì)性狀的影響。結(jié)果表明，3類群牦牛在CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)檢測(cè)到g.100+606G＞T突變，形成了AA、BB和AB 3種基因型，檢測(cè)區(qū)域表現(xiàn)為中度多態(tài)；CAPN1基因第1內(nèi)含子突變影響不同年齡段甘南牦牛肌肉嫩度、失水率和眼肌面積，AA基因型個(gè)體嫩度剪切力值較低而眼肌面積較高，其中3歲和5歲牦牛AA型個(gè)體嫩度剪切力顯著低于BB或AB型（P＜0.05），4歲和5歲牦牛AA型個(gè)體眼肌面積顯著高于BB或AB型（P＜0.05）；另外6歲牦牛AA型個(gè)體失水率顯著高于BB 和AB型（P＜0.05）。CAPN1基因g.100+606G＞T突變可用為甘南牦牛此類性狀潛在的遺傳標(biāo)記之一。

甘南牦牛；CAPN1基因；多態(tài)性；胴體和肉質(zhì)性狀

牛肉品質(zhì)反映肉牛生產(chǎn)性能。評(píng)價(jià)牛肉品質(zhì)的指標(biāo)主要包括風(fēng)味、嫩度和多汁性等，而決定牛肉品質(zhì)的最重要因素則是嫩度［1］，Doumit等［2］報(bào)道，嫩度剪切力值小于4.1 kg·f的牛排能使98%消費(fèi)者感到滿意。鈣蛋白酶（Calpain）也稱CAPN（calcium activated neutral protease），是存在所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的半胱氨酸巰基內(nèi)肽酶，在神經(jīng)發(fā)育、肌肉生長(zhǎng)、成肌細(xì)胞融合與分化、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及膜蛋白裂解等方面有重要作用［3］。自Guroff［4］首次發(fā)現(xiàn)CAPN基因至今，已有14個(gè)CAPN基因被克隆鑒定［5］。CAPN1屬鈣蛋白酶家族，是降解肌原纖維蛋白重要的蛋白酶，肌肉嫩度與CAPN1活性調(diào)節(jié)有關(guān)。金海麗等［6］認(rèn)為可以通過(guò)基因調(diào)控技術(shù)抑制鈣蛋白酶的活性，從而達(dá)到提高肌肉生長(zhǎng)的目的。Koohmaraie等［7］證明了蛋白酶水解系統(tǒng)中只有鈣蛋白酶與肌肉嫩化有關(guān)聯(lián)，后又證明了與肌肉嫩化相關(guān)的鈣蛋白酶的主要是CAPN1。Melody等［8］發(fā)現(xiàn)豬肉嫩度、系水力與蛋白質(zhì)降解、CAPN1的活性和自溶有關(guān)；Pringle等［9］發(fā)現(xiàn)牛肉嫩度和CAPN1的活性相關(guān)，并不明顯與鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）活性有關(guān)聯(lián)，而CAPN1與CAST活性比值與嫩度高度相關(guān)。Smith等［10］將CAPN1基因作為牛肉嫩度候選基因。Morris等［11］證實(shí)了CAPN1基因可以作為嫩度的分子遺傳標(biāo)記選擇之一。

試驗(yàn)采用了PCR-SSCP方法，分析甘南牦牛、天祝白牦牛及大通牦牛CAPN1基因intron 1的突變，分析該突變對(duì)甘南牦牛嫩度等性狀的影響，從而尋找與牦牛肉質(zhì)和胴體性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，充實(shí)牦牛胴體及肉質(zhì)性狀的遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物肉質(zhì)性狀測(cè)定

共采取了816頭牦牛血樣，其中甘南牦牛694頭（甘南藏族自治州夏河縣160頭，甘南藏族自治州瑪曲縣534頭），天祝白牦牛72頭，大通牦牛50頭。血樣使用ACD抗凝劑抗凝并保存于-70℃。

記錄采集血樣的牦牛信息，包括牛編號(hào)、性別和年齡。從甘南牦牛眼肌部位采集肉樣以測(cè)定肉質(zhì)性狀，其中嫩度用C-LM3型數(shù)顯式嫩度儀測(cè)定剪切力值并參照《肉嫩度的測(cè)定 剪切力值測(cè)定法》（NY/T 1180—2006）進(jìn)行校正。測(cè)定甘南牦牛宰后胴體質(zhì)量，以及眼肌面積，其中眼肌面積測(cè)定時(shí)用硫酸紙描下胴體12～13肋骨間眼肌橫斷面，然后用求積儀測(cè)定其面積。測(cè)量失水率方法是將肉樣置于35 kg壓力儀5 min，肉樣前后的質(zhì)量差與加壓前的質(zhì)量比值則為失水率；熟肉率為將肉樣于蒸鍋加蓋蒸30 min后，取出冷卻2 h后的質(zhì)量占蒸煮前質(zhì)量百分比。

1.2 提取基因組DNA

基因組DNA的提取運(yùn)用苯酚-氯仿法［12］從甘南牦牛血樣中提取。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

應(yīng)用Primer 5軟件并根據(jù)GenBank公布的牦牛CAPN1基因序列（登錄號(hào)：NW_005393546）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)殛笈APN1基因intron 1的部分序列。上游引物：5′-CCTTCCTCGTTCCTTGTGCTA-3′，下游 引物：5′-CCCAAGCCTGTGGTTTCC-3′。

PCR反應(yīng)總體積20 μL：基因組 DNA 0.8 μL，上下游引物各0.8 μL，TaKaRa Premix Taq預(yù)混酶10.0 μL，ddH2O為7.6 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 SSCP檢測(cè)及等位基因序列測(cè)定

取3 μL的PCR產(chǎn)物，加入7 μL變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10 mmol·L-1EDTA），98℃變性10 min，迅速冰浴5 min后，上樣到14%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Scr=39∶1），280 V電壓、水循環(huán)溫度18℃電泳18 h。然后用銀染法［13］染色并判定基因型。

對(duì)等位基因?yàn)榧兒闲偷膫€(gè)體進(jìn)行測(cè)序，而對(duì)等位基因僅存在于雜合個(gè)體的則在SSCP條帶切膠并重新擴(kuò)增后再測(cè)序［14］。測(cè)序結(jié)果來(lái)自北京六合華大基因公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型分析CAPN1基因第1內(nèi)含子突變對(duì)甘南牦牛胴體及肉質(zhì)性狀的影響。隨著年齡的增大，動(dòng)物肌肉中結(jié)締組織含量增多，致使肌肉嫩度下降［15］，所以對(duì)甘南牦牛群體分年齡段分析基因突變對(duì)肉質(zhì)的影響。其統(tǒng)計(jì)模型為：

式中：Yijk為性狀表型值，μ為群體均值；Genotypei為基因型效應(yīng)；Genderj為性別效應(yīng)；Allelei為等位基因效應(yīng)；eijk為隨機(jī)誤差。

圖1 不同基因型的牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子PCRSSCP電泳圖Fig.1 PCR-SSCP pattern of CAPN1 intron 1 region in yak

圖2 牦牛CAPN1第1內(nèi)含子基因序列對(duì)比Fig.2 Alignment of allelic sequences of intron 1 of CAPN1 in yak

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛CAPN1基因PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

圖1為牦牛CAPN1基因PCR產(chǎn)物SSCP的電泳帶型。在引物擴(kuò)增區(qū)域發(fā)現(xiàn)2種SSCP帶型，分別為等位基因A和B，形成AA、BB和AB 共3種基因型。

2.2 牦牛CAPN1基因等位基因序列比對(duì)

3類群牦牛CAPN1基因引物擴(kuò)增區(qū)域各等位基因序列比對(duì)見圖2。與GenBank下載的牦牛CAPN1基因序列（登錄號(hào)：NW_005393546）比對(duì)，等位基因A存在g.100+606G＞T的突變。

2.3 牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)的多態(tài)性

牦牛CAPN1基因群體遺傳多態(tài)性分析如表1所示。甘南牦牛和天祝白牦牛等位基因A和B頻率基本一致，大通牦牛等位基因B為優(yōu)勢(shì)等位基因。

一般通過(guò)多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）、純合度（homozygosity，Ho）、遺傳雜合度（heterozygosity，He）和有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）衡量群體遺傳多態(tài)性，進(jìn)而估測(cè)群體的選擇潛力。甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因檢測(cè)區(qū)域多態(tài)信息含量均為0.25＜PIC＜0.5，屬中度多態(tài)。甘南牦牛和天祝白牦牛卡方值均顯著（P＜0.01），偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。大通牦牛卡方值未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4 甘南牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)突變與胴體及肉質(zhì)性狀相關(guān)性

運(yùn)用一般線性模型GLM對(duì)不同年齡甘南牦牛CAPN1第1內(nèi)含子基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)的聯(lián)分析見表2。應(yīng)用等位基因“缺失/存在”方法［16］分析等位基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的影響見表3。方差分析結(jié)果表明，CAPN1基因第1內(nèi)含子突變對(duì)不同年齡甘南牦牛肉質(zhì)性狀有一定影響。天祝白牦牛和大通牦牛因?yàn)闆](méi)有生產(chǎn)數(shù)據(jù)，所以不能做相關(guān)性分析。

表1 牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)遺傳多態(tài)性分析Table 1 Genetic diversity in intron 1 of CAPN1 in yak

表2 甘南牦牛CAPN1第1內(nèi)含子基因型與胴體及肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析Table 2 Association analysis of genotypes of CAPN1 intron 1 with carcass and meat quality traits in Gannan yak

表3 甘南牦牛CAPN1第1內(nèi)含子等位基因與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association analysis of alleles of CAPN1 intron 1 with carcass and meat traits in Gannan yak

CAPN1基因第1內(nèi)含子突變影響甘南牦牛肌肉嫩度。3～6歲牦牛AA型個(gè)體嫩度剪切力值均較低，其中基因型與3歲和5歲牦牛肌肉嫩度剪切力值顯著相關(guān)（P＜0.05）。各基因型間多重比較表明，3歲牦牛AA型個(gè)體嫩度剪切力值顯著低于BB和AB型（P＜0.05），5歲甘南牦牛AA和BB型個(gè)體嫩度顯著低于AB型（P＜0.05）；3歲甘南牦牛攜帶等位基因A的個(gè)體嫩度剪切力值顯著小于未攜帶個(gè)體（P＜0.05），而攜帶等位基因B個(gè)體嫩度顯著大于未攜帶個(gè)體（P＜0.05）。

CAPN1基因第1內(nèi)含子突變影響甘南牦牛眼肌面積。4～6歲牦牛AA型個(gè)體眼肌面積均較高，其中基因型與4歲和5歲牦牛眼肌面積顯著相關(guān)（P＜0.05）。4歲牦牛AA型個(gè)體眼肌面積顯著大于BB和AB型（P＜0.05），5歲牦牛AA型個(gè)體顯著大于BB型（P＜0.05）。等位基因B對(duì)甘南牦牛眼肌面積有不利影響，攜帶等位基因B個(gè)體眼肌面積均低于未攜帶個(gè)體，其中4歲牦牛攜帶等位基因B個(gè)體眼肌面積顯著低于未攜帶個(gè)體（P＜0.05）。

3～6歲牦牛AA型個(gè)體肌肉失水率均較高。其中CAPN1基因第1內(nèi)含子突變與6歲牦牛失水率顯著相關(guān)（P＜0.05），即AA型個(gè)體失水率顯著高于BB和AB型（P＜0.05）。攜帶等位基因B個(gè)體失水率均較低，其中6歲牦牛攜帶等位基因B個(gè)體失水率顯著低于未攜帶個(gè)體（P＜0.05），表明等位基因B能增加牦牛宰后肌肉保水性。CAPN1基因第1內(nèi)含子突變對(duì)甘南牦牛熟肉率和酮體質(zhì)量無(wú)顯著影響。

3 討論

甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn) g.100+606G＞T的SNPs，構(gòu)成AA、BB和AB基因型，3類群牦牛多態(tài)性信息含量為中度多態(tài)。田璐等［17］研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)西門塔爾牛CAPN1基因存在CAPN1 316和CAPN1 4 751兩個(gè)SNPs位點(diǎn)，多態(tài)性信息含量分別為0.07（低度多態(tài)）和0.37（中度多態(tài)）；吳孝杰等［18］在牦牛CAPN1基因第10 581 bp、5 837 bp發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SNPs位點(diǎn)，多態(tài)信息含量分別為0.332 3（中度多態(tài)）、0.152 0（低度多態(tài)）。本研究結(jié)果與以上研究均一致。

內(nèi)含子雖然是基因中無(wú)編碼功能的序列，但其對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有著重要作用［19］。在一些基因中內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)具有正調(diào)控作用，Chang［20］發(fā)現(xiàn)豬MyHC基因內(nèi)含子中存在重要的調(diào)控元件，可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始來(lái)增強(qiáng)基因表達(dá)。在一些基因中內(nèi)含子則表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控作用，張靜等［21］研究發(fā)現(xiàn)CART基因內(nèi)含子中的NRSF序列參與介導(dǎo)了該基因的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控作用。免疫球蛋白、IGF2、FSHβ、CPT-ivα、β-肌動(dòng)蛋白和β角蛋白基因的內(nèi)含子突變也引起基因表達(dá)效應(yīng)發(fā)生變化［22］。因此，牦牛CAPN1基因內(nèi)含子突變研究對(duì)了解與分析該基因遺傳特征及其對(duì)性狀影響仍然有重要意義。

甘南牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子突變影響其肌肉嫩度，AA基因型個(gè)體肌肉嫩度剪切力值較低，其中3歲、5歲牦牛AA型個(gè)體嫩度剪切力顯著低于BB或 AB型（P＜0.05）。Hoagland等［23］認(rèn)為內(nèi)源蛋白酶是引起肌肉嫩化的主要酶類，葉滿紅［24］報(bào)道鈣蛋白酶參與了動(dòng)物屠宰后肌肉蛋白水解，從而導(dǎo)致肌肉嫩化。鈣蛋白酶家族中CAPN1和CAPN2都能水解肌原纖維，但人們普遍認(rèn)為 CAPN1是參與肌肉嫩化的主要酶［25］。Morgan等［26］也報(bào)道CAPN1是動(dòng)物宰后肌肉嫩化的主要酶。許多文獻(xiàn)證實(shí)CAPN1基因突變影響牛肉嫩度，Page等［27-28］發(fā)現(xiàn)CAPN1基因兩個(gè)錯(cuò)義突變與牛肉嫩度顯著相關(guān)，并在Angus和Brahman雜交牛中證實(shí)上述兩個(gè)突變對(duì)嫩度有累加作用。姜成國(guó)等［29］報(bào)道草原紅牛、延邊牛CAPN1基因第14內(nèi)含子區(qū)突變影響肉質(zhì)嫩度的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)（蒸煮損失、肌纖維直徑、剪切力、滴水損失等），但與屠宰性狀（凈肉重、酮體質(zhì)量、凈肉率等）無(wú)關(guān)；Veiseth等［30］研究表明，CAPN1基因可以改善牛肉嫩度，同時(shí)對(duì)生產(chǎn)和胴體性狀無(wú)負(fù)效應(yīng)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的 CAPN1基因第1內(nèi)含子突變可作為甘南牦牛肌肉嫩度性狀選擇的分子標(biāo)記之一。

CAPN1基因第1內(nèi)含子突變影響甘南牦牛肌肉失水率和眼肌面積，其中6歲甘南牦牛AA型個(gè)體失水率顯著高于BB和AB型（P＜0.05），4歲、5歲牦牛AA型個(gè)體眼肌面積顯著高于BB 或AB型（P＜0.05）。系水力指肌肉受外力作用時(shí)保持其原有水分的能力，牦牛屠宰后，pH值下降，肌肉蛋白質(zhì)正負(fù)電荷間的平衡發(fā)生變化，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷的數(shù)量減少，吸附水的能力下降。Chen等［31］研究顯示，系水力越強(qiáng)，肉質(zhì)越細(xì)嫩；姜昊［32］研究發(fā)現(xiàn)草原紅牛CAPN1基因947位點(diǎn)突變對(duì)系水力有顯著影響；吳孝杰［33］研究發(fā)現(xiàn)牦牛CAPN1基因第13內(nèi)含子突變對(duì)失水率也有顯著影響。在眼肌面積方面，韓瑞華［34］研究發(fā)現(xiàn)秦川牛及其雜種牛CAPN1基因第2外顯子1 278位發(fā)生C→T的突變，MM型個(gè)體的宰前活重、酮體質(zhì)量和眼肌面積顯著高于MB個(gè)體；候冠彧［35］發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛等9個(gè)群體中CAPN1基因MaeⅡ位點(diǎn)的多態(tài)與眼肌面積之間存在顯著相關(guān)。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果也類似。

4 結(jié)論

甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因第1內(nèi)含子區(qū)檢測(cè)到1處SNP，該突變影響不同年齡段甘南牦牛肌肉嫩度、失水率、眼肌面積等胴體及肉質(zhì)性狀，AA基因型個(gè)體肌肉嫩度剪切力值較低、眼肌面積較高而肌肉保水性較差，并在部分年齡段牦牛中達(dá)顯著水平。該突變位點(diǎn)可作為甘南牦牛此類性狀選擇的遺傳標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯 盧福莊）

Polymorphism in the intron 1 of CAPN1 and its association with carcass and meat quality traits in yak

CHEN Jie1，TIAN Zhi-li1，HU Jiang1，*，LUO Yu-zhu1，LIU Xiu1，WANG Ji-qin1，SHI Hong-mei2，LEI Jun-jie2
（1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University/Gangsu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070，China；2.Institute of Animal Husbandry Science of Gannan Prefecture，Hezuo 747000，China）

The single nucleotide polymorphisms（SNPs）of CAPN1 gene in Gannan yak，Tianzhu yak and Datong yak were detected by the technology of PCR-SSCP.The relationship between SNPs and Gannan yak carcass and meat quality traits was analyzed.The results of PCR-SSCP indicated that there was a genetic mutation of g.100+606G＞T in the first introns of CAPN1 gene of all 3 groups to form 3 genotypes（AA，AB and BB）.Genetic analyses of CAPN1 gene showed that the polymorphism information contents in the detection region were 0.25＜PIC＜0.50，which belonged to a moderate polymorphism.Meat tenderness degree，water loss rate，eye muscle area of different age periods of Gannan yaks were regulated by genetic mutation of CAPN1.Lower shear force was observed in AA type yaks aged 3 and 5 years when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）.Higher eye muscle area was observed AA type yaks aged 4 and 5 years old when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）.Moreover，high-er water loss rate was observed in 6 years old AA type yaks when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）. Genetic mutation of g.100+606G＞T could be used as genetic markers.

Gannan yak；CAPN1 gene；polymorphism；carcass and meat quality traits

S823.8+5

A

1004-1524（2016）08-1315-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.07

2016-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160451）；甘肅省杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目（1210RJDA008）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-38）

陳杰（1991—），男，福建福安人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與生產(chǎn)研究。E-mail：269454336@qq.com
*

，胡江，E-mail：huj@gsau.edu.cn