5個綿羊品種CAST基因多態(tài)性及其與肉品質(zhì)的相關(guān)性

王 華，王建福，王欣榮，成述儒，李曉梅，王志明，樊慶山，富麗霞，李 雙，周曉霞（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

5個綿羊品種CAST基因多態(tài)性及其與肉品質(zhì)的相關(guān)性

王 華，王建福，王欣榮，成述儒*，李曉梅，王志明，樊慶山，富麗霞，李 雙，周曉霞
（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

為從分子水平研究甘肅境內(nèi)典型養(yǎng)殖模式下甘肅高山細(xì)毛羊、小尾寒羊、藏羊、蒙古羊和灘羊5個綿羊品種的CAST基因多態(tài)性與肉品質(zhì)的相關(guān)性，探討以CAST為候選基因，提高綿羊肉品質(zhì)的可能性。采用PCR-SSCP技術(shù)對5個綿羊品種的CAST基因內(nèi)含子3多態(tài)性進(jìn)行檢測，并就CAST基因多態(tài)性與9月齡肉品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析。根據(jù)比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與等位基因A相比，等位基因B發(fā)現(xiàn)G62T以及C110T突變，等位基因C發(fā)現(xiàn)C92T突變，形成AA、AB、BB和AC 4種基因型；經(jīng)檢驗(yàn)表明，5個綿羊品種均處于非Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；群體遺傳多態(tài)性分析表明，5個綿羊品種的多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)；關(guān)聯(lián)分析表明，5個綿羊品種CAST基因變異位點(diǎn)的4個基因型間失水率AC基因型顯著高于其他基因型（P＜0.05），對于剪切力AC基因型顯著低于其他3種基因型（P＜0.05）；不同綿羊品種間基因型分析表明，對于5個綿羊品種AC基因型的失水率顯著高于其他3種基因型，除蒙古羊外，AC基因型的剪切力顯著低于其他基因型；變異對眼肌面積沒有顯著性影響。這些關(guān)聯(lián)說明CAST基因可作為候選基因用于綿羊產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)的分子標(biāo)記輔助選擇。

綿羊；PCR-SSCP；CAST基因；肉質(zhì)性狀；關(guān)聯(lián)性分析

嫩度是對羊肉品質(zhì)評價的一個重要特征，同時嫩度也是決定肉品質(zhì)量的主要因素，多年來一直是國內(nèi)外肉品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。影響肉嫩度的因素包括肌節(jié)的長度、結(jié)締組織的含量、肌原纖維蛋白的降解程度、畜體的年齡、糖酵解的速度、pH值、可溶性膠原蛋白等。國內(nèi)外學(xué)者對肌原纖維蛋白的降解做了大量研究，發(fā)現(xiàn)肉中存在的鈣蛋白酶系統(tǒng)對肌肉在成熟過程中的嫩化起一定的調(diào)控作用，是肌原纖維蛋白降解的限速步驟［1］，這引起了科研人員的廣泛關(guān)注。

鈣蛋白酶系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，參與細(xì)胞的一系列進(jìn)程，包括生長、凋亡、遷移和細(xì)胞周期等［2］，該系統(tǒng)包括鈣蛋白酶（CAPN）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）和鈣蛋白酶激活蛋白（calpain activator），三者相互作用，通過參與肌原纖維蛋白的降解過程影響肌肉生長及嫩化［3］。鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）是鈣蛋白酶系統(tǒng)的一個重要成員，是細(xì)胞內(nèi)高效、需 Ca2+的內(nèi)源性專一抑制CAPN活性的蛋白質(zhì)，它可以識別CAPN與鈣結(jié)合引起的構(gòu)象變化并與之特異性結(jié)合，通過抑制CAPN的自溶對其進(jìn)行抑制調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)蛋白的水解速率［4-5］。研究證實(shí)，CAST基因是家畜肉質(zhì)尤其是嫩度性狀的候選基因之一。對豬CAST基因的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的肌肉除肌內(nèi)脂肪和背膘厚差異顯著外［6］，其嫩度、屠宰45 min后pH值和滴水損失也存在顯著差異［7-8］。對雞的CAST基因研究表明，雞的肌纖維密度和直徑與CAST基因有顯著相關(guān)性［9］；對牛的研究也發(fā)現(xiàn)，CAST不同基因型與該酶的活性、胴體性狀及牛肉剪切值相關(guān)［10-11］。燕鳳［12］研究綿羊的CAST基因表達(dá)量與背最長肌失水率有顯著性負(fù)相關(guān)的結(jié)果。本試驗(yàn)利用PCR-SSCP對綿羊CAST基因多態(tài)性檢測，確定不同基因型效應(yīng)值與肉品質(zhì)性狀的顯著性檢驗(yàn)，以期為綿羊肉品質(zhì)的遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動物

選用3月齡甘肅本地5個綿羊品種共250只，靜脈采血，均為6 mL·頭-1，ACD抗凝，-20℃凍存。9月齡時對各綿羊品種的每個基因型隨機(jī)選取3只按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屠宰，測定肉質(zhì)品質(zhì)。

1.2 性狀測定

主要測定 pH值（pH value）、失水率（drip loss，DP）剪切力（shear force，SF）、蒸煮損失率（cooking loss rate，CLR）、眼肌面積（Loin muscle area，LMA）。所有性狀的測定根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T17238-1998執(zhí)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考 GenBank數(shù)據(jù)庫綿羊登錄號（FJ843091.1），用primer 5.0對CAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列CAST-up 5-′CTCTTGGACTTTTGAACTGTA-3′，CAST-low 5′-CCACGTGAGTATTCTAAGCA-3′。

1.4 DNA提取及PCR反應(yīng)體系和程序

采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL，模板DNA 1.0 μL（100 μmol·L-1），上、下游引物各1.0 μL （10 μmol·L-1），mixTaq酶12.5 μL（1.25 U），加ddH2O至總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 4 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。

1.5 PCR-SSCP分析

取PCR產(chǎn)物2 μL與8 μL上樣緩沖液混勻，然后98℃變性10 min，迅速冰浴5 min，用移液槍將變性樣品點(diǎn)于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠［m（Acr）∶m（Bis）=39∶1］中，180 V，8℃電泳12 h，硝酸銀染色判型。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對CAST基因內(nèi)含子3基因多態(tài)性位點(diǎn)在不同綿羊群體中的基因型分布進(jìn)行分析，配合下列模型進(jìn)行最小二乘分析，比較各項(xiàng)觀察值在CAST基因型之間的差異。

式中：Yijkm為個體某性狀表型值，μ為總體均值，Gi為基因型效應(yīng)，BFj為第j個品種和羊場的合并固定效應(yīng)，Lk為地區(qū)效應(yīng)，Sm為性別效應(yīng)，eijkm為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

對CAST基因進(jìn)行擴(kuò)增，隨機(jī)選擇若干個樣品的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與目的片段（309 bp）大小一致且特異性好，可用于SSCP分析。

2.2 SSCP檢測與判型

對CAST基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析發(fā)現(xiàn)4種基因型（圖2），定義4種基因型為AA、AB、BB和AC。

2.3 CAST基因第3內(nèi)含子測序結(jié)果比對

序列多重比對結(jié)果如圖3所示。與等位基因A相比，等位基因B在62和110 bp處分別發(fā)生了G→T、C→T突變，等位基因C在92 bp處發(fā)生了C→T突變。

2.4 CAST基因型頻率和基因頻率分析

圖1 PCR擴(kuò)增Fig.1 Detection of PCR product

圖2 CAST基因擴(kuò)增序列產(chǎn)物的SSCP檢測結(jié)果Fig.2 PCR-SSCP analysis of CAST gene

圖3 等位基因A、B、C序列比對結(jié)果Fig.3 Alignment results of alleles A，B，C sequence

采用群體遺傳學(xué)方法，分析5個綿羊品種CAST基因變異位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率。結(jié)果表明，甘肅高山細(xì)毛羊等位基因A基因頻率最高為0.62，蒙古羊最低為0.58（表1）。不同的綿羊群體中等位基因A的頻率都在0.5以上，為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率為A＞B＞C。5個綿羊品種AA基因型所占比例最多，屬于優(yōu)勢基因型。

2.5 CAST基因多態(tài)位點(diǎn)的遺傳特性

對CAST基因多態(tài)性在5個綿羊群體中表現(xiàn)的遺傳特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2），結(jié)果表明，5個綿羊品種的多態(tài)信息含量介于0.25～0.50，為中度多態(tài)。純合度都在0.6以上，為高度純合。5個綿羊品種均偏離哈代溫伯格平衡。

2.6 不同基因型與綿羊肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

由表3可以看出，變異位點(diǎn)引起的4種基因型，對pH值、蒸煮損失率和眼肌面積沒有顯著性影響，但AC基因型失水率顯著高于其他基因型（P＜0.05），對于剪切力，AC基因型顯著低于其他3種基因型（P＜0.05）。

2.7 不同綿羊品種肉品質(zhì)相關(guān)性分析

不同基因型對不同綿羊肉品質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果（表4）表明，5個綿羊品種AC基因型的失水率顯著高于其他3種基因型（藏羊和灘羊的BB基因型除外）；除蒙古羊外，AC基因型的剪切力顯著低于其他基因型。

表1 基因型頻率和基因頻率Table 1 Genotypic frequency and allelic frequency

表2 五個綿羊品種純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量分析和哈代溫伯格平衡Table 2 Analysis of Ho，He，PIC and Hardy-Weiberg in 5 sheep breeds

表3 不同基因型與綿羊肉品質(zhì)的相關(guān)性分析Table 3 Association analysis of sheep meat quality traits in different genotypes

3 討論

3.1 基因的遺傳特性

CAST基因在各個綿羊群體中的PIC均處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），說明甘肅地方綿羊在這個位點(diǎn)的遺傳變異較大，這可能與甘肅地方綿羊在雜交選育中的高度選擇有關(guān)，突變位點(diǎn)均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明遺傳漂變和人工選育等因素對群體造成了很大影響。

表4 不同基因型對不同綿羊品種肉品質(zhì)的影響Table 4 Effect of different genotypes on meat quality of different sheep varieties

3.2 基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)系

Calpain基因家族在肉質(zhì)嫩化上起到了重要的作用［13-14］，而CAST基因作為抑制Calpain的基因，抑制肌原纖維蛋白質(zhì)的降解［15］，從而影響羊肉嫩化。目前我國肉質(zhì)標(biāo)記輔助選擇（Markerassistedselection，MAS）的研究多集中于豬，孫立彬等［6］研究了CAST基因多態(tài)性與豬肉品質(zhì)和背膘厚相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)不同基因型與肌內(nèi)脂肪和背膘厚度之間呈顯著相關(guān)；吳舊生等［16］研究了金皮豬CAST基因的多態(tài)性與肌纖維組織學(xué)特性和屠宰性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn) CAST多肽位點(diǎn)不同基因型與肌纖維橫截面積和眼肌面積呈顯著相關(guān)。針對地方綿羊及肉質(zhì)性狀相關(guān)候選基因的研究還較局限。CAST基因由于其功能涉及成肌細(xì)胞的分化和融合，被認(rèn)為與家畜肉質(zhì)尤其是嫩度相關(guān)。Smith等［17］的研究證實(shí)，CAST基因與肉嫩度和剪切力顯著相關(guān)，這與 Casas等［18］和 White等［19］的研究結(jié)論一致。Bolormaa等［20］利用GWAS技術(shù)分析了澳大利亞肉牛的肉質(zhì)和屠宰性狀，在檢測到的所有SNP中，包括存在于CAST基因上的突變位點(diǎn)C，A2832G位點(diǎn)的SNP，同樣與牛肉嫩度和剪切力呈顯著相關(guān)。

本研究以甘肅典型養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖數(shù)量最多的5個綿羊品種為研究對象對，CAST基因 3內(nèi)含子部分序列進(jìn)行多態(tài)性分析，并對該位點(diǎn)基因型多態(tài)性與多種肉質(zhì)性狀進(jìn)行差異顯著性分析。分析結(jié)果表明，5個綿羊品種CAST基因第3內(nèi)含子區(qū)存在豐富的多態(tài)性，這些基因多態(tài)性與其肉質(zhì)性狀存在一定相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)引起5個綿羊品種的失水率顯著提高，除蒙古羊外，突變引起的剪切力顯著低于其他基因型。而本研究中并未發(fā)現(xiàn)此處的突變位點(diǎn)對綿羊眼肌面積、pH值存在顯著影響，與吳舊生等［16］的結(jié)果不一致，以上研究結(jié)論的不一致，可能與品種對不同性狀影響的差別或數(shù)量性狀受多基因調(diào)控作用影響及研究樣本量不夠多有關(guān)。因此，下一步可擴(kuò)大樣本數(shù)量，或篩選其他SNP位點(diǎn)探討CAST基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。

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（責(zé)任編輯 盧福莊）

Association analysis of CAST gene polymorphism with meat quality in five sheep breeds

WANG Hua，WANG Jian-fu，WANG Xin-rong，CHENG Shu-ru*，LI Xiao-mei，WANG Zhi-ming，F(xiàn)AN Qingshan，F(xiàn)U Li-xia，LI Shuang，ZHOU Xiao-xia
（Faculty of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

In order to study the relationship between the CAST gene polymorphism and meat quality of 5 sheep breeds （Gansu alpine fine wool sheep，Small tail han sheep，Tibetan，Mongolian sheep and Tan-sheep which were fed in a typical farming mode of Gansu province）in Gansu Province at the molecular level and to explore the possibility of improving the quality of sheep meat by using CAST as a candidate gene，the polymorphism of intron 3 of CAST gene was detected by PCR-SSCP in 5 sheep breeds，and the association between CAST gene polymorphism and meat quality in 9-month-old sheep was analyzed.The results showed：compared with allele A，two mutations were detected which included G62T and C110T in allele B while only C92T was detected in allele C.The mutations formed AA，AB，BB and AC genotypes.Experimental results showed that 5 sheep breeds were in non-Hardy-Weinberg equilibrium state.Population genetic polymorphism analysis showed that the polymorphism information content（PIC）of the 5sheep breeds was moderate.The association analysis showed that the water loss rate of AC genotype was significantly higher than those of others（P＜0.05），the shear forcer of AC was significantly lower than those of other three genotypes（P＜0.05）.Genotype analysis of different sheep breeds showed that the water loss rate of AC genotype was significantly higher than other three genotypes（P＜0.05），and the shear stress of AC genotype was significantly lower than other genotypes（P＜0.05）except Mongolia sheep.The mutation locus had no significant influence on eye muscle area.These associations showed CAST gene could be used as a candidate gene for marker-assisted selection of sheep meat performance and meat quality.

sheep；PCR-SSCP；CAST gene；meat quality traits；association analysis

S826.8

A

1004-1524（2016）08-1309-06

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.06

2016-01-12

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2012-26）

王華（1990—），男，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：957777293@qq.com
*

，成述儒，E-mail：chengsr@gsau.edu.cn