溫腎活血化濕方對腎間質纖維化大鼠腎組織NF-κB表達的影響*

李建省，靳 鋒，王寶蕊甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

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溫腎活血化濕方對腎間質纖維化大鼠腎組織NF-κB表達的影響*

李建省，靳 鋒，王寶蕊
甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

目的：探討溫腎活血化濕方對單側輸尿管梗阻（uni l at eral uret eral obst ruct i on，U U O）法致腎間質纖維化大鼠腎組織核轉錄因子-κB（N F-κB）表達的影響，初步揭示該方防治腎間質纖維化的作用機制。方法：采用U U O建立大鼠腎間質纖維化模型，將雄性SD大鼠80只隨機分為假手術組、U U O組、氯沙坦組和溫腎活血化濕方組，每組20只；于造模后第2天開始灌胃，假手術組、U U O組給予等量生理鹽水，氯沙坦組灌胃氯沙坦［10 m g/（kg·d）］，溫腎活血化濕方組灌溫腎活血化濕方湯劑［9.8 m g/（kg·d）］。于造模后第7、14、21天留取梗阻側腎組織行H E、M asson染色，觀察腎組織病理變化，免疫組化法檢測腎組織N F-κB的表達。結果：第7、14、21天U U O組中N F-κB表達較假手術組高（P＜0.05），治療組在第7天較U U O組低（P＜0.05）。結論：溫腎活血化濕方可能通過抑制N F-κB的過度表達從而延緩腎間質纖維化的進程。

腎間質纖維化；腎組織核轉錄因子；溫腎活血化濕方；大鼠

WenShen HuoXue HuaShi prescription；the rats

腎間質纖維化(RIF)是各種慢性腎臟病進展至慢性腎衰竭的主要原因之一。慢性腎功能衰竭發病率高、治療困難，RIF在腎臟疾病轉歸中起主導作用，其病變程度與慢性腎臟病的預后密切相關。尋求其早期可逆因子或防治措施對腎臟疾病轉歸具有重要意義，是目前醫學界研究的熱點。目前抗RIF的治療多采用抗RAS系統藥物、抗氧化劑、免疫抑制劑、他汀類藥、活性維生素D、吡非尼酮等干預，但效果不甚理想。中醫藥工作者從中醫病因、病機、治法方面進行研究，并從單味中藥、有效成分及中藥復方防治RIF方面進行了大量臨床及實驗研究，效果滿意。在前期的臨床研究中發現溫腎活血化濕方具有改善腎功能，降低尿蛋白，延緩慢性腎功能衰竭的功效。本研究利用UUO法復制腎間質纖維化大鼠模型，觀察溫腎活血化濕方對腎組織結構及N F-κB表達的影響，初步探討其防治腎間質纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型復制 將清潔級3～4周齡SD雄性大鼠120只［體質量100～140 g，蘭州大學醫學院動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(甘)2009-0004］隨機分為4組：假手術組、UUO組、溫腎活血化濕方組、氯沙坦組，每組30只。參照文獻［1］采用單側輸尿管結扎手術(UUO 法)建立腎間質纖維化大鼠模型。其余各組以5%水合氯醛3.5 m L/kg腹腔注射麻醉，從右側旁正中切口剪開腹壁，暴露右側輸尿管，結扎右側輸尿管，關閉腹腔。假手術組只分離但不結扎輸尿管。術后第2天給藥，假手術組、UUO組給予等量生理鹽水，氯沙坦組灌胃給予氯沙坦［10 m g/(kg·d)］混懸液，溫腎活血化濕方組給予溫腎活血化濕方(由黃芪、川芎、續斷、牛膝、菟絲子、桂枝、白豆蔻等組成，以上藥物經我院制劑室經水煮提取，含生藥2 g/m L，按換算系數換算成大鼠灌胃給藥)水煎液［9.8 m g/(kg·d)］。術后第7、14、21天分別平均處死每組大鼠10只，切除右腎，甲醛固定、脫水后包埋備用。

1.2 腎組織病理檢測 取右側腎組織切片，進行蘇木素-伊紅(H E)、M asson染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態結構變化情況

1.3 免疫組織化學法檢測N F-κB表達情況 按照兩步法免疫組化檢測試劑盒(H RP-多聚體抗兔，武漢博士德生物公司提供)操作步驟，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復染，光鏡下觀察腎組織N F-κB的表達。光鏡下細胞核、細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性信號。采用Im age-Pro Pl us 6.0圖像分析軟件半定量分析免疫組化圖片。根據累計吸光度與面積的比值，選取10個不重疊視野，進行統計分析。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以(±s)表示，組間多重比較采用SN K-q檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 腎組織病理學改變 H E、M asson染色觀察：假手術組腎小管排列整齊，無萎縮，腎臟病理改變不明顯。UUO組可見腎間質水腫，上皮細胞腫脹，炎性細胞浸潤，腎小管擴張，伴有腎小管萎縮；2治療組腎小管病變程度較UUO組減小。

2.2 免疫組化染色結果 假手術組腎小管上皮細胞、腎間質細胞胞漿陽性染色較弱；UUO組與假手術組比較，胞核中陽性染色強。UUO組隨著時間的延長，腎小管上皮細胞、腎間質細胞胞漿陽性染色減少。UUO組在術后第7、14、21天陽性染色面積均明顯高于假手術組(P＜0.05)。2治療組在術后7天陽性染色面積較UUO組減少(P＜0.05)，術后21天時UUO組與氯沙坦組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質N F-κB表達的相對吸光度值比較(±s)

表1 各組大鼠腎小管間質N F-κB表達的相對吸光度值比較(±s)

注：★表示與假手術組比較，P＜0.05；△表示與U U O組比較，P＜0.05；●表示與氯沙坦組比較，P＜0.05。

組別 只數 7 d 14 d 21 d假手術組 30 0.42±0.21 0.39±0.18 0.41±0.20 U U O組 30 2.93±0.72★●1.65±1.41★1.32±0.58★●氯沙坦組 30 0.87±0.36△0.77±0.39 0.35±0.13△溫腎活血化濕方組 30 0.55±0.30△0.54±0.24 0.64±0.45

3 討論

目前，腎間質纖維化動物模型有單側輸尿管梗阻(unil ateralureteralobstructi on，UUO)動物模型、環孢素A腎病動物模型、5/6腎切除(subtotalnephrectom y，STN x)模型等。UUO模型是研究腎小管間質纖維化公認的模型。輸尿管結扎導致腎間質纖維化，引起腎臟彌漫性損害［2-3］。

N F-κB是一種介導細胞內信號轉導的重要轉錄因子，具有多向性調節作用，調控一系列重要的免疫因子表達，參與腎組織損害及腎纖維化形成過程［2-3］。當受到外界信號的刺激時，N F-κB由靜止狀態存在于胞漿中的非活性形式迅速活化，并移到胞核中參與基因的轉錄調控及一系列重要的免疫因子表達，參與腎組織損害過程［4-6］。

腎間質纖維化屬中醫學“關格”“溺毒”“水腫”“虛損”等范疇。劉玉寧認為“虛、痰(濁)、瘀、毒”是導致腎間質纖維化發生、發展的關鍵；樊均明以“腎痿”立論；王獻耀教授提出“腎絡微型癥瘕”是腎纖維化的中醫病機?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺撈氛f：“陽氣者若天與日，失其所，則折壽而不彰。”《類經附翼》說：“天之大寶，只此一丸紅日，人之大寶，只此一息陽氣?！薄澳I為五臟之本”，陽氣的盛衰對機體正常的生理活動至關重要。腎中陽氣衰虧，則五臟六腑皆失所恃，而陰陽病變無所不至，故溫陽法為其治療大法［7］。筆者認為虛、瘀、痰濕是導致慢性腎臟病腎間質纖維化發生、發展的關鍵。腎虛為本，痰(濁)、瘀為標，毒是加重腎間質纖維化不可忽視的方面。因此，溫腎活血化濕法治療慢性腎臟病臨床效果滿意。

目前，國內外研究證實TGF-β1/Sm ad信號轉導通路、EM T與腎間質纖維化密切相關。在前期研究中發現，溫腎活血方治療慢性腎臟病腎間質纖維化具有較好的臨床療效，并且發現溫腎活血方能夠降低UUO大鼠細胞外基質，腎陽虛腎絡瘀阻為腎間質纖維化主要病機，溫腎活血化濕方具有溫腎活血、健脾化濕之功效。已有研究證實［8］，黃芪、川芎能調節細胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能，或通過下調TGF-β和α-SM A表達，或抑制腎小管轉分化、下降ECM的主要成分、下調TGF-β、CTGF表達等多途徑多靶點抑制腎小管上皮細胞增殖，抑制腎小管上皮細胞轉分化，改善腎間質纖維化。中藥補腎益氣法能抑制成纖維細胞過度活化，促進其凋亡［9］。補腎活血法及其中藥可以加速細胞外基質降解，減少細胞外基質積聚，防治腎小球硬化［10］。益氣活血方通過下調TGF-β、sm ad 2和上調sm ad 7的表達來抑制CTGF表達，進而遏制腎纖維化的進展［11］。

本研究結果表明溫腎活血化濕方具有良好的抗腎纖維化作用，通過減少TGF-β1的表達和減少N F-κB蛋白的活化，使細胞外基質合成及沉積減少，減輕腎間質纖維化，為溫腎活血化濕方進一步研究提供實驗依據。

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Influence of WenShen HuoXue HuaShi Prescription on the Expressions of NF-κB in Renal Tissue of the Rats with Renal Interstitial Fibrosis

LI Jianshen，JIN Feng，WANG Baorui
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China

Objective：To reveal the mechanism of WenShen HuoXue HuaShi prescription in preventing and treating renal interstitial fibrosis initially by exploring its influence on the expressions of nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue of unilateral ureteral obstruction（UUO）induced rat model with renal interstitial fibrosis.Methods：Rat model with renal interstitial fibrosis was established by UUO method，eighty rats were separated into sham operation group，UUO group，losartan group and WenShen HuoXue HuaShi prescription group，20 rats each group；they began to lavage from the second day after successfully establishing the models，the rats in the sham operation group and UUO group accepted intragastric administration of physiological saline in the same amounts，losartan group losartan ［10 mg/（kg·d）］，WenShen HuoXue HuaShi prescription group WenShen HuoXue HuaShi decoction［9.8 mg/（kg·d）］.In the seventh，14th and 21st day after successful establishing the models，renal tissue from the obstructed kidney were taken out and dyed by HE and Masson，to observe pathological changes of renal tissue，the expressions of NF-κB were detected in renal tissue by immunohistochemical method.Results：The expressions of NF-κB in UUO group were higher than these of sham operation group in the seventh，14th and 21st day （P＜0.05），the treatment group was lower than UUO group in the expressions of NF-κB at the seventh day（P＜0.05）.Conclusion：WenShen HuoXue HuaShi prescription could delay the progression of renal interstitial fibrosis by inhibiting over expressions of NF-κB possibly.

renal interstitial fibrosis；nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue；

李建?。?976—），男，博士學位，副主任醫師。研究方向：慢性腎臟疾病的中醫藥防治。

R975.5

A

1004-6852（2016）01-0019-03

2015-02-27

甘肅省自然科學基金項目（編號1308RJZA 164）；甘肅省高等學校科研項目（編號2013A-082）。