膀胱及尿路上皮癌中CD44s的表達及臨床意義

王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業，劉學軍，任玉林，薛國強

（甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

膀胱及尿路上皮癌中CD44s的表達及臨床意義

王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業，劉學軍，任玉林，薛國強

（甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達，研究其對膀胱及尿路上皮癌的早期診斷價值。方法 收集膀胱及尿路上皮癌患者70例作為實驗組，收集膀胱黏膜組織正常的患者20例作為對照組，從病理分期和臨床分期兩個方面，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）對CD44s進行定量分析。結果 CD44s蛋白在正常膀胱黏膜上皮無表達，拷貝數小于1× 102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽性表達是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數均大于1×104copies/ml。CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級間比較，有顯著性差異P〈0.05）。結論 CD44s與膀胱及尿路上皮癌的早期診斷具有相關性，可作為判斷膀胱及尿路上皮癌分化程度、臨床分期的參考指標。

膀胱及尿路上皮癌；CD44s；早期診斷

膀胱腫瘤的復發、浸潤和轉移由腫瘤細胞的多種生物學行為所決定，其中腫瘤細胞的黏附能力是重要方面。CD44最初被確認為一種淋巴細胞歸巢受體和跨膜糖蛋白，一般表達在胚胎干細胞［1］，在淋巴細胞、成纖維細胞和增生的上皮細胞中都可檢測到，也可見于腫瘤細胞的表面［2］。大量的研究表明，CD44及其變異體在腫瘤的發生和發展過程中起著重要的作用，與乳腺癌、結腸癌、腎癌、膽管癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長、侵襲和轉移有密切聯系［3-4］，而與膀胱及尿路上皮癌的關系目前仍未得出統一的結論。本研究應用實時熒光定量PCR技術從基因水平檢測CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達，旨在探討CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發生、復發、浸潤、轉移及預后方面的關系，現介紹如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取本院泌尿外科2010年1月—2014年1月行膀胱部分切除或全切除手術患者70例作為實驗組，所有病例標本均經病理證實為膀胱及尿路上皮癌，其中男56例，女14例；年齡29～83歲，平均56歲；根據國際抗癌協會（UTCC）制訂的TNM分期標準，Tis-a期13例，T1期24例，T2期20例，T3期9例，T4期4例；病理I級25例，Ⅱ級23例，Ⅲ級22例；初發組48例，復發組22例；單發組49例，多發組21例。正常膀胱黏膜組（對照組）20例，標本取自經恥骨上前列腺摘除術患者，經病理證實為正常膀胱黏膜組織。

1.2儀器

API7500實時熒光定量PCR儀。

1.3主要試劑

核酸提取液B、Taq酶系、CD44s PCR MIX、CD44s陽性質控品、CD44s陰性質控品，均來自北京索奧生物醫藥科技有限公司。

1.4實驗過程

1.4.1DNA提取 取約50 mg膀胱黏膜組織轉移至1.5 ml干凈離心管中，加1ml生理鹽水混勻，用研磨器研制成勻漿，12000rpm離心5分鐘，棄上清液，沉淀加50 μl核酸提取液（DNA），充分混勻，100℃處理10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清液4 μl 做PCR反應。

1.4.2PCR擴增從試劑盒中取出CD44s PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10 000 rpm離心10秒。CD44s引物序列為Forward Primer：GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC Reverse Primer GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC，測試反應體系配置為：CD44s PCR MIX 24 μl、Taq酶系2 μl。向設定的N個PCR反應管中分別加入26 μl反應體系，向每管中加入處理后的樣品或CD44s陽性質控品（使用前用陰性質控品梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，記為1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml）和陰性質控品4 μl，10 000 rpm瞬時離心3秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性質控品、陽性質控品以及未知標本，并設置反應體系（30 μl）、樣品名稱，標記熒光基團種類（報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA）和循環條件：95℃30秒，后95℃5秒，60℃30秒，40個循環。

1.4.3繪制標準曲線的條件 r值=0.99，CD44s陽性表達值（Ct值）≤35，基因拷貝數為1×104copies/ml。

1.5統計學方法

用SPSS13.0軟件進行方差分析和t檢驗，兩樣本率的比較行χ2檢驗，P〈0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各待測反應管曲線圖（見圖1～4）

圖1　TNM分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖2　WHO病理分級CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖3　臨床分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖4　不同腫瘤數量CD44s熒光定量PCR曲線圖

2.2CD44s與膀胱及尿路上皮癌的關系

CD44s在正常膀胱黏膜上皮無表達，在70例膀胱及尿路上皮癌標本中陽性表達31例，陽性率為44.3%。CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發生、發展及復發之間的關系見表1。

表1　CD44s不同表達在不同TNM分期、不同WHO病理分級、腫瘤是否復發及不同腫瘤數量的人數分布（人）

結果顯示，CD44s與膀胱及尿路上皮癌TNM分期的關系：CD44s的表達在淺表性（Tis-a～T1）與浸潤性（T2～T4）膀胱及尿路上皮癌中比較，差異有統計學意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌WHO病理分級的關系：CD44s表達隨病理分級增加而升高，高分化膀胱及尿路上皮癌（I級）與低分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅱ級、Ⅲ級）之間比較，差異有統計學意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌復發的關系：CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌是否復發的患者中比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌數量的關系：CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌單發和多發患者中比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3　討論

（1）腫瘤的生長依賴于腫瘤細胞與宿主組織外基質之間的相互作用。CD44屬于黏附分子家族中的成員，廣泛分布于細胞表面，是一種蛋白形式的細胞表面黏附因子，參與細胞-細胞、細胞-基質之間的特異性粘連過程［5］。人類CD44基因位于11號染色體短臂（11p13）上，長約92 kb，至少有21個外顯子，根據編碼蛋白的表達方式分為兩型：其中10個固定外顯子位于基因兩端，每端5個，轉錄時固定表達，其轉錄片段存在于所有CD44蛋白中，稱為標準型CD44基因（CD44s）；在固定的外顯子中間有6～15個外顯子僅表達于核RNA的剪接體中，轉錄時只存在于一定的CD44轉錄子中，表達不固定，稱為變異體CD44v基因，主要包括變異體CD44v1～10［6-7］。

（2）CD44s是存在于多種組織細胞的表面糖蛋白，而CD44v蛋白主要存在于發育成熟階段的組織器官細胞表面［8］。近年來，國內外學者通過基因水平、蛋白水平兩個方面檢測尿液中CD44，從而對膀胱腫瘤的分化、浸潤、數量、轉移、復發及預后做了大量的研究。目前關注較多的主要是 CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10對膀胱腫瘤的診斷。CD44s及CD44v的異常表達與膀胱及尿路上皮癌的發生、發展有著密切的聯系，但目前仍未得出統一的結論，多數學者的研究結果認為：CD44s表達缺失同時伴有CD44v表達增高與腫瘤分化程度較差、分期較晚有顯著關系［9］。Ross等研究結果認為，CD44s在膀胱及尿路上皮癌中持續表達，但在分化差的浸潤性癌中表達下降。Stevevn等［10］研究認為，膀胱及尿路上皮癌組織和正常膀胱黏膜組織中都有CD44s和CD44v2蛋白的表達，結果CD44v2與腫瘤的分級、分期無關，認為CD44v2不能作為診斷膀胱癌的指標。

（3）本研究應用實時熒光定量PCR方法，從基因水平檢測了人正常膀胱黏膜及膀胱和尿路上皮癌組織中CD44s的表達，探討了CD44s表達與膀胱尿路上皮癌TNM分期、WHO病理分級、腫瘤數量及復發的關系，結果CD44s在正常膀胱黏膜上皮無表達，拷貝數小于1×102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽性表達是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數均大于1×104copies/ml。CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級組間比較，有顯著性差異（P〈0.05），CD44s檢測有助于對膀胱及尿路上皮癌的早期診斷，具有臨床診斷價值［11］。

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1671-1246（2016）16-0133-03

蘭州市科技計劃項目（2012-1-3）