自噬對脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的影響

張文龍，張培茂，朱月浩，陰文超，高華萍，劉文值

(攀枝花學院附屬醫院麻醉科,四川攀枝花 617000)

?

自噬對脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的影響

張文龍，張培茂，朱月浩，陰文超，高華萍，劉文值

(攀枝花學院附屬醫院麻醉科,四川攀枝花 617000)

目的研究自噬對脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的影響。方法將48只SD大鼠平均分為4組:(1)生理鹽水對照組(NS組)；(2) 脂多糖(LPS)模型組(L組)；(3)LPS+自噬組(L+A)；(4)LPS+自噬抑制組(L+I)。血氣分析檢測動脈血氧分壓(PaO2)、動脈二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值;計算肺組織干濕比；HE染色觀察肺組織病理學變化并進行肺損傷評分;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清和肺泡灌洗液中微管關聯蛋白LC3b、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達。結果與NS組比較,L組動脈血PaO2、pH值降低，PaCO2升高(P<0.05);與L組相比,L+A組動脈血PaO2、pH值上升,PaCO2下降(P<0.01)；L+I組動脈血PaO2、pH值降低，PaCO2升高(P<0.01)，差異具有統計學意義。L組和L+I組血清和肺泡灌洗液中LC3b水平降低，MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α水平均升高，而L+A組正好相反。結論自噬對脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷起到改善或保護作用。

自噬；脂多糖；急性肺損傷；抗炎；肺保護

急性肺損傷(acute lung in jury,ALI)是由多種炎性介質及效應細胞共同參與,多發病環節介導，呈級聯放大的瀑布樣炎癥，多繼發彌漫性肺實質損傷和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。ALI常惡化為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),二者均表現為彌漫性肺泡實質損傷和急性、進行性呼吸窘迫以及頑固性低氧血癥，本質是失控的炎性反應。雖對ALI進行了大量研究，但病死率仍達40%～70%，若伴有膿毒癥則更高[2-4]。自噬(autophagy)即細胞質內大分子物質(如脂質、微生物等)被轉運至溶酶體進行水解，包括微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)[5-7]。微自噬主要是溶酶體膜直接包裹長壽命蛋白，并在溶酶體內降解[8]；巨自噬則由內質網來源的膜包繞待降解物形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體融合而降解其內容物[9-10]；CMA胞質內蛋白結合分子伴侶后被轉運到溶酶體腔，然后被消化為可溶的蛋白質分子[11]。在缺氧、應激及損傷情況下，自噬亦表現為抗炎和細胞保護作用[12-14]。本研究以脂多糖誘導大鼠ALI，探索自噬在ALI中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物由攀枝花學院醫學院實驗動物中心提供的健康清潔級雄性SD大鼠48只,體質量(250±30)g,2.5～3.0月齡,按隨機、對照原則分為4組(n=12):即生理鹽水對照組(NS組)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模型組(L組)； LPS+自噬組(L+A)；LPS+自噬抑制組(L+I)。

1.2儀器與試劑大腸桿菌內毒素LPS(L2880，Sigma)；LC3b、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)；蘇木素染液(碧云天)。MK3 型酶標儀(賽默飛儀器有限公司)；德國Effendorf 5810R離心機；BX40F4型光學顯微鏡(Olympus，日本)；AxioCam ERC5s 成像系統(德國蔡司)；自動血氣分析儀(Stat Profile pHOx，Nova Biomedical公司,美國)。

1.3實驗方法

1.3.1分組方法采用隨機數字法將48只大鼠平均分為4組，各組大鼠分別以10%水合氯醛經腹腔注射麻醉(4 mL/kg)，固定大鼠，無菌操作下作頸部正中切口使氣管暴露，按各組要求滴注相關藥物：(1)NS組：氣管滴注0.9%氯化鈉注射液5 mg；(2)L組：氣管滴注LPS 2.5 mg+0.9%氧化鈉注射液 2.5 mg；(3)L+A組：氣管滴注LPS 2.5 mg+雷帕霉素2.5 mg；(4)L+I組：氣管滴注LPS 2.5 mg+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)2.5 mg。注入后迅速將動物直立并旋轉，使藥液均勻分布在肺中，待大鼠呼吸平穩后縫合傷口。注射0.9%氧化鈉注射液、LPS及相關藥物24 h后，收集標本。

1.3.2標本采集經頸部正中切開皮膚,逐層分離肌肉,暴露氣管，用16號氣管導管進行插管，固定后用預冷的PBS進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)，4 ℃ 1 300 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。經腹部正中切開皮膚,逐層分離肌肉,暴露胸膜；剪破胸膜，打開胸腔，暴露心臟和肺，左心室取血，進行血氣分析并離心取上清液4 ℃ 1 800 r/min離心10 min，-80 ℃保存。分離肺組織，取右肺上葉進行干濕比檢測，右肺中葉用10%中性多聚甲醛固定行HE染色，冰面上取左肺置液氮中速凍后放入-80 ℃低溫冰箱保存備用。

1.4檢測指標

1.4.1肺組織干濕比取出右肺上葉,濾紙吸干表面水分,置入一潔凈的小玻璃瓶中,精確稱取濕重(W)后,置75 ℃恒溫烤箱中,烘烤24 h至恒重后測定肺組織干重(D),計算W/D以評估肺組織的水腫程度。

1.4.2蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色取右肺中葉用10%中性甲醛固定24 h后,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚度4 mm),HE染色。光鏡下觀察肺組織病理學變化并進行病理學評分。評分標準:對肺泡充血(alveolar congestion)、出血(hemorrhage)、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集(PMN)、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成(transparent membrane)4項指標,分別根據病變輕重評0～4分。0分:無病變或病變非常輕微；1分:輕度病變；2分:中度病變；3分:重度病變；4分:極重度病變。各項評定分數相加為ALI病理學總評分。

1.4.3動脈血氣分析測定動脈血氧分壓(PaO2)、動脈二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值。

1.4.4血清和BALF微管關聯蛋白LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β、TNF-α檢測用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α的水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2　結　　果

2.1各組大鼠肺干濕比與NS組比較，L組大鼠的肺組織干濕比增加；與L組比較，L+A組肺組織干濕比下降，L+I組肺組織干濕比增加(圖1)。

A：各組大鼠肺干濕比比較；B：各組HE染色病理學評分比較。

圖1大鼠肺干濕比及HE病理染色評分比較

圖2　　肺組織HE染色病理切片

2.2HE染色、ALI病理學評分比較與NS組比較,L組ALI評分升高(P<0.01)。與L組比較,L+A組ALI評分降低(P<0.05),而L+I組評分較L+A組高(P<0.01)，見圖2。光鏡下見NS組肺泡結構完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄，未見肺水腫和炎性細胞浸潤。L組肺泡腔變窄,肺間質及肺泡腔內有充血、水腫細胞和炎性細胞浸潤。L+A組肺泡腔輕度擴大，肺間質及肺泡腔內少量紅細胞和炎性細胞浸潤，輕度充血水腫。L+I組肺泡結構破壞，肺泡腔更窄，肺泡間隔明顯增厚，肺間質及肺泡充血、水腫、大量炎性細胞浸潤，且肺泡腔內有大量的紅細胞及滲出物,HE染色結果見圖2。

2.3動脈血氣分析各組大鼠間的動脈血氣分析差異有統計學意義，其中L組和L+I組PaCO2顯著升高、PaO2和pH值降低，可能與肺部損傷較嚴重有關；而L+A組大鼠的PaCO2降低、PaO2升高和pH值相對升高，自噬的參與可能緩解了ALI的炎癥和病理改變，起到肺保護的作用。

2.4大鼠血清和BALF的炎性因子水平通過ELISA試劑盒的檢測，大鼠血清和BALF的LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α水平L+I組增加明顯，而L+I組下降。由此可見，L組炎性反應最重，L+I組次之，L+A組較輕，NS組則最輕(圖4～6)。

表2　　各組大鼠PaO2、PaCO2、pH值變化比較

圖3　　大鼠動脈血氣分析

A、C:血清；B、D:BALF。

圖4大鼠BALF及血清LC3b、IL-1β表達

A、C:血清；B、D:BALF。

圖5大鼠BALF及血清TNF-α、MPO的表達

A:BALF；B：血清。

圖6大鼠BALF及血清MIP-2的表達

3　討　　論

ALI或ARDS為臨床常見的危重癥，主要引起肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調最為常見，導致急性或持續性呼吸功能不全。在缺氧、應激及各種損傷等情況下，細胞通過自噬維持著細胞及周邊的內環境和穩態。自噬可能通過相關的信號通路，如MAPK、NLRP3炎癥小體和核因子(NF)-κB等激活細胞內趨化因子、炎癥介質及細胞因子的釋放，起到調控炎癥發生發展的作用[15-16]。而自噬在細胞成分更新、保持旺盛的生理狀態和維持細胞穩態方面以及腫瘤、心腦血管、自身免疫和神經退化性等疾病中扮演的重要角色已為大家所熟知。在LPS誘導的ALI模型中，主要通過TLR4誘導自噬生成，與受體相關蛋白-Toll樣受體相關的干擾素活化，及線粒體活化蛋白激酶p38有密切關系[7]。由此推測，在各種原因所致的肺損傷中自噬也發揮重要作用。有研究顯示[17]，自噬在線粒體氧化磷酸化障礙導致的三磷酸腺苷(ATP)合成不足和活性氧聚積導致的肺損傷中也發揮重要作用，但具體機制尚不清楚。本研究通過LPS誘導ALI模型的建立，分別經氣管給予促進大鼠肺泡細胞自噬作用的雷帕霉素及抑制肺泡細胞自噬作用的3-甲基腺嘌呤處理。對比發現，經雷帕霉素處理的大鼠肺組織水腫較其他組明顯減輕，干濕比有所下降，肺泡腔輕度擴張，炎性細胞浸潤減弱，肺間質充血及水腫等病理評分，較3-甲基腺嘌呤抑制自噬處理后的大鼠肺組織病理評分更低。雷帕霉素屬于新型大環內酯類抗生素，主要用于抗真菌的治療，同時它可通過不同的細胞因子阻斷淋巴細胞等免疫信號的傳導，從而具備免疫抑制的功能，起到降低機體炎性反應的目的，一定程度上促進了自噬的發生。3-甲基腺嘌呤作為抑制自噬的常規藥物，已在科研中得到廣泛應用。微管關聯蛋白LC3b是目前公認的自噬分子標記抗體，在自噬中扮演重要作用。從4組大鼠BALF及血清ELISA檢測可知，雷帕霉素處理后的LPS模型中LC3b明顯升高，且MPO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達均顯著降低(接近于未經LPS處理的對照組)。同時，血氣分析提示經雷帕霉素處理后的LPS模型組氧分壓更高，二氧化碳分壓接近正常值，對機體的酸堿內環境影響更小。不難看出，經雷帕霉素處理后，大鼠自噬作用增強，對ALI起到明顯的改善或保護作用，為臨床干預或治療ALI/ARDS拓展了新的視野。

[1]Monahan LJ.Acute respiratory distress syndrome[J].Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care,2013,43(10):278-284.

[2]Angus DC，van der Poll T．Severe sepsis and septic shock[J]．N Engt J Med，2013，369(21)：2063．

[4]Matthay MA,Zimmerman GA,Esmon C,et al.Future research directions in acute lung injury:summary of a National Heart,Lung,and Blood Institute Working Group[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167(7):1027-1035.

[5]Leikauf GD,Mcdowell SA,Wesselkamper SC,et al.Acute lung injury:functional genomics and genetic susceptibility[J].Chest,2002,121(3 Suppl):70-75.

[6]Moran M,Delmiro A,Blazquez A,et al.Bulk autophagy,but not mitophagy,is increased in cellular model of mitochondrial disease[J].Biochim Biophys Acta,2014,1842(7):1059-1070.

[6]Gomes LC,Scorrano L.Mitochondrial morphology in mitophagy and macroautophagy[J].Biochim Biophys Acta,2013,1833(1):205-212.

[8]王星童，李恒宇，夏照帆．自噬與膿毒癥肺損傷間關系的研究進展[J]．中華燒傷雜志，2014，30(4)：325-328．

[9]Valdor R,Macian F.Autophagy and the regulation of the immune response[J].Pharmacol Res,2012,66(6):475-483.

[10]Ahang J.Autophagy and mitophagy in cellular damage control[J].Redox Biol,2013,1(1):19-23.

[11]Ding WX,Yin XM.Mitophagy:mechanisms,pathophysiological roles,and analysis[J].Biol Chem,2012,393(7):547-564.

[12]Lu SZ,Harrison-Findik DD.Autophagy and cancer[J].World J Biol Chem,2013,4(3):64-70.

[13]Oka T,Hikoso S.Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure[J].Nature,2012,485(7397):251-255.

[14]Bernard NJ.Connective tissue diseases:How do autoreactive B cells survive in SLE--autophagy?[J].Nat Rev Rheumatol,2014,10(3):128.

[15]Takeda W,Kitada M.Kanasaki K.SIRT1 inactivation induces inflammation through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,427(1):191-196.

[16]Nakahira K,Haspel JA,Rathinam VA,et al.Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome[J].Nat Immunol,2011,12(3):222-230.

[17]Zhao W,Li YL,Jia LX,et al.Atg5 deficiency-mediated mitophagy aggravates cardiac inflammation and injury in response to angiotensin Ⅱ[J].Free Radic Biol Med,2014(69):108-115.

Influence of autophagy on rat acute lung injury induced by lipopolysaccharide

ZhangWenlong,ZhangPeimao,ZhuYuehao,YinWenchao,GaoHuaping,LiuWenzhi

(DepartmentofAnesthesiology，AafiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China)

ObjectiveTo explore the influence of autophagy on lipopolysaccharide(LPS) induced acute lung injury(ALI).Methods Forty-eight Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups,12 cases in each group: (1)normal saline control group (NS),(2)LPS model group (L),(3) LPS and autophagy group (L +A) and (4) LPS and autophagy inhibition group (L+I).Arterial blood samples was obtained for detecting the blood gas,including PaO2,PaCO2and pH,and the lung tissue dry/wet ratio was calculated.The HE staining was used to observe the histopathological changes of lung tissue.Moreover the lung lesion score was performed;the expression of microtubule associated protein,light chain protein 3b(LC3b),myeloperoxidase(MPO),macrophage inflammatory protein 2(MIP-2),interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was assessed by ELISA.ResultsCompared with the NS group,arterial blood PaO2and pH in the group L were decreased and PaCO2was increased (P<0.05);compared with the L group,the arterial blood PaO2and pH in the L+A group were increased and PaCO2was declined (P<0.01),the arterial blood PaO2and pH in the L+I group were decreased and PaCO2was elevated,the differences were statistically significant(P<0.01).The LC3b concentration in serum and BALF in the L group and L+I group was declined,while MPO,MIP-2,IL-1β and TNF-α concentrations were increased,while which in the L+A group were just the opposite.ConclusionAutophagy plays a improvement and protective effect on LPS induced acute lung injure in rat.

autophagy;lipopolysaccharide;acute lung injury;anti-inflammation;lung protection

張文龍(1981-)，主治醫師，本科，主要從事臨床麻醉、疼痛方面的研究。

R563

A

1671-8348(2016)20-2756-04

2015-12-21

2016-03-05)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.006