Rap1基因在斑馬魚胚胎早期發育過程中的時空表達譜研究*

楊小燕，何志旭,2△，舒莉萍，金　皎，黃　璟，吳莎莎，馬健娟

(1.貴州醫科大學附屬醫院兒科　550004；2.貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心　550004；3.貴州醫科大學免疫學教研室，貴陽 550004)

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Rap1基因在斑馬魚胚胎早期發育過程中的時空表達譜研究*

楊小燕1，何志旭1,2△，舒莉萍2,3，金皎1，黃璟1，吳莎莎1，馬健娟1

(1.貴州醫科大學附屬醫院兒科550004；2.貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心550004；3.貴州醫科大學免疫學教研室，貴陽 550004)

目的選擇斑馬魚作為實驗動物模型，研究Rap1基因在胚胎早期發育過程中的時空表達規律。方法從斑馬魚胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段，將Rap1基因片段和pCS2+質粒進行體外連接重組，重組質粒經雙酶切、菌落聚合酶鏈反應(PCR)及測序鑒定正確后，經T3RNA體外轉錄體系合成DIG標記的Rap1基因反義mRNA探針，采用整胚原位雜交方法檢測Rap1在斑馬魚胚胎早期發育過程的表達情況。結果在斑馬魚胚胎0.75 hpf的細胞分裂連接處、3.70 hpf和6.00 hpf的動物極、12.00～72.00 hpf的脊索神經部位均可見Rap1基因的陽性雜交信號。結論Rap1基因在斑馬魚脊索神經系統的早期發育過程中可能起到重要的調控作用。

Rap1基因；斑馬魚；原位雜交；基因表達

Rap1又稱Ras相關GTP結合蛋白，是Kitayama在篩選NIH/3細胞中抑制Ras蛋白轉化功能的蛋白分子過程中發現的。Rap1的兩個亞型：Rap1a和Rap1b在氨基酸序列上具有超過90%的同源性，且與Ras蛋白有高度同源性。Rap1和其他G蛋白一樣，表現為無活性的GDP結合形式和有活性的GTP結合形式兩種構象[1-2]。最初的研究認為Rap1主要是通過直接與Ras的下游效應子相互作用來干擾Ras信號通路，但最近更多的研究結果表明Rap1是一個功能獨立的信號通路,通過控制不同的信號通路參與調節細胞的粘連、細胞間連接形成、細胞極性和細胞的增殖與分化[3-4]。目前，隨著研究的進展，對Rap1基因的生物學功能有了較為深入的認識，但Rap1基因在活體內的表達情況報道較少，本研究選擇斑馬魚作為模式生物，通過克隆Rap1基因，采用全胚胎原位雜交技術(whole mount in situ hybridization，WISH)探求Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎早期發育過程中的表達情況,進而為Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎發育早期功能的研究建立一定的基礎。

1　 材料與方法

1.1實驗動物本實驗所選的野生型斑馬魚Tuebingen和pCS2+質粒由上海生命科學院饋贈。斑馬魚養殖根據Westerfield[5]描述的方法進行,水溫28.5 ℃，交替給予照明14 h，黑暗10 h，定時喂以餌料。直至雌、雄斑馬魚生殖功能發育成熟后，將雌、雄斑馬魚按1∶1或1∶2進行交配,次日清晨收集斑馬魚受精卵，斑馬魚胚胎的發育階段按文獻[5]描述的形態特征區分。為了方便觀察原位雜交結果，受精后超過24 h的胚胎給予0.003%苯硫脲(PTU) 處理防止黑色素形成,收集后的胚胎經固定、脫水后保存于-20 ℃備用。

1.2試劑聚合酶鏈反應(PCR)引物(北京諾賽生物有限公司)，質粒小抽試劑盒(Axygen公司)，限制性內切酶ClaI 和XbaI(Tiangen公司)，T3酶(Ambion公司),BCIP/NBT Alkaline phosphatase substrate kitⅣ(Vector Laboratories公司)， T4連接酶(FBI公司)，Trizol(Invitrogen公司)，DIG RNA Labeling mix 和Anti-digoxigenin AP-conjungate(Roche公司)，生物學顯微鏡(Nikon SMZ645)，雜交爐(美國UVP公司HL-2000),紫光分光光度儀(島津UV1700)，LRH系列生化培養箱(上海一恒科技有限公司)。

1.3克隆斑馬魚Rap1基因根據斑馬魚cDNA文庫中Rap1基因組序列，用Premier5.0軟件設計引物，正向引物序列：CCA TCG ATA TGC GTG AAT ACA AGT TAG；反向序列引物：GCT CTA GAT TTC ACC CGC AGA ATT TG,同時引入ClaI 、XbaI酶切位點及保護堿基。以收集0.75～72.00 hpf多個時相的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎提取的總RNA逆轉錄得到的cDNA為模板進行RT-PCR擴增，條件為： 40 ℃ 30 min，30個循環(94 ℃ 8 min，94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃ 10 min，PCR產物大小為321 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4pCS2+-Rap1重組質粒的構建pCS2+質粒利用鈣轉法轉入Ecoli DH5α感受態菌中，通過氨芐抗性篩選出陽性克隆，擴增后運用堿裂解法提取pCS2+質粒DNA，用ClaI和XbaI雙酶切pCS2+質粒，1%瓊脂糖電泳后割膠回收。將Rap1基因的PCR產物用ClaI和XbaI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，將上述割膠回收產物在T4酶的作用下相連接，將連接產物運用鈣轉法轉入Ecoli DH5α感受態菌中，經氨芐抗性篩選出陽性克隆并擴增后，運用堿裂解法提取pCS2+-Rap1重組質粒。

1.5pCS2+-Rap1重組質粒的鑒定(1)雙酶切鑒定：用ClaI和XbaI雙酶切pCS2+-Rap1重組質粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切產物大小；(2)菌落PCR鑒定：pCS2+-Rap1b重組質粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷擴增產物大小；(3)序列測定鑒定：將重組質粒送至北京賽諾生物技術公司測序鑒定。

1.6地高辛標記的Rap1基因反義mRNA的制備將pCS2+-Rap1重組質粒用ClaI進行單酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒割膠回收得到線性化的pCS2+-Rap1重組質粒。利用T3體外轉錄體系，以線性化的pCS2+-Rap1重組質粒DNA為模板，以地高辛標記的寡核苷酸為原料，經體外轉錄得到地高辛標記的Rap1反義mRNA探針后，用NucAwaylM Spin Columns純化吸附柱回收Rap1反義mRNA探針，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后于-70 ℃保存備用。

1.7斑馬魚全時相胚胎原位雜交(WISH)原位雜交按照Kyryachenko等[6]的方法進行，收集Tuebingen野生型斑馬魚(0.75、3.70、6.00、12.00、18.00、24.00、36.00、48.00、72.00 hpf)9個時相點的胚胎各20枚，多聚甲醛固定胚胎，甲醛梯度脫水后-20 ℃保存備用、第1天在室溫下用1×PBST洗去多余甲醛溶液，將胚胎移入68 ℃雜交爐中預雜交1 h，然后加入Rap1基因反義mRNA探針后68 ℃雜交過夜。第2天洗去多余的探針后，加入anti-GIG-AP與Rap1基因反義mRNA探針結合過夜。第3天用1×PBST洗去未結合的抗體，再加入BCIP/NBT溶液顯色，在體視顯微鏡下觀察并記錄結果后，用固定液對雜交胚胎進行再固定并且照相。

2　結　　果

2.1Rap1基因RT-PCR擴增結果在圖1中于第2泳道位200～500 bp可見一特異性擴增條帶，大小與預期321 bp相符；同時，第3泳道500 bp處可見一條帶，為內參GAPDH的PCR產物，大小與預期結果相符。

2.2pCS2+-Rap1重組質粒酶切鑒定結果將pCS2+- Rap1重組質粒及pCS2+質粒用ClaI和XbaI雙酶切，結果顯示：第2泳道為重組質粒雙酶切后得到的Rap1基因片段，與PCR產物大小一致，而雙酶切后得到的載體DNA片段與第3泳道載體雙酶切片段大小一致，見圖2。

2.3pCS2+-Rap1重組質粒菌液PCR鑒定結果以重組質粒菌液作為模板進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示，200～500 bp可見一特異性PCR片段，大小與預期結果相符，見圖3。

1：DNA Marker Ⅲ；2：Rap1 PCR產物；3：GVPDH PCR產物；4：空白對照。

圖1Rap1基因RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

1：DNA MarkerⅢ；2：pCS2+- Rap1重組質粒；3：pCS2+；4：空白對照。

圖2pCS2+- Rap1重組質粒與pCS2+載體質粒ClaI和XbaI雙酶切結果

1：DNA Marker Ⅲ；2：Rap1 PCR產物；3：空白對照。

圖3pCS2+- Rap1重組質粒菌液PCR結果

2.4pCS2+- Rap1重組質粒測序結果在Genbank中比對后顯示，測序結果與Rap1基因一致，見圖4。

2.5Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎中的表達情況全胚胎原位雜交結果表明，在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎0.75～72.00 hpf發育過程中均可檢測到Rap1基因表達信號，但表達部位不同。Rap1在受精后0.75 hpf集中出現在細胞分裂連接處，3.70 hpf和6.00 hpf普遍性表達，斑馬魚體節形成期12.00 hpf開始特異性表達于胚胎脊索部位，表達逐漸增強，30.00 hpf達高峰，之后Rap1在斑馬魚胚胎脊索部位表達信號逐漸減弱，一直持續至72.00 hpf，見圖5。

圖4pCS2+-Rap1重組質粒測序結果

圖5　　Rap1基因在野生型斑馬魚早期發育過程中的表達情況

3　討　　論

斑馬魚作為一種新興的模式生物是研究基因功能的有效載體，全基因組測序已完成，其與哺乳動物在分子途徑調控上高度保守。另外，與其他模式生物相比，斑馬魚是體外受精和發育，體積小，生殖周期短，生殖能力強，胚胎發育快且胚體透明，可以高效、連續和動態觀察胚胎的發育[7-9]。WISH可以從整體水平反映胚胎發育過程中基因表達的時空順序，常被廣泛應用于胚胎發育調控基因表達的研究[10]。通過對斑馬魚胚胎進行原位雜交，可以從三維、立體角度觀察Rap1基因在斑馬魚胚胎體內的表達情況，這將為進一步研究Rap1基因的分子調控機制提供一定的理論基礎。

Rap1基因屬于Ras超家族的小GTP結合蛋白之一。Rap1被激活之后，通過調節下游效應分子將信號傳導入細胞核內，參與一系列生物學活動[11-12]。研究表明，Rap1調節細胞間黏附，影響細胞間黏附連接的定位和完整性[13-14]。Rap1GEFs，如PDZ-GEF和C3G，直接連在E-鈣黏蛋白或其他連接蛋白上，影響細胞的連接功能[15]；此外，Rap1 在細胞連接處累積，如Rap1 的效應分子fadin/AF6 和某些調控肌動蛋白骨架的蛋白，都是連接蛋白[16-17]。本研究結果發現Rap1在胚胎細胞分裂連接處有Rap1表達信號，從體內試驗證實了Rap1基因在細胞黏附連接形成位點局部可能發揮著重要作用。

細胞的極性是多數細胞的共同特征，是細胞分化和細胞行使正常功能的基礎,細胞極性的建立對于生物體的生長發育至關重要。研究顯示，Rap1參與了果蠅胚胎細胞極性的建立，并起到關鍵作用[18-19]。本研究發現Rap1基因在胚胎發育早期動物極廣泛表達，可見Rap1基因為母源性表達基因，其在胚胎早期生長發育過程中起著重要作用。此外，從斑馬魚受精后12.00 hpf體節形成開始至72.00 hpf，在斑馬魚胚胎脊索均可見Rap1表達，表達信號隨著體節生長發育逐漸增強，于30.00 hpf達高峰，48.00 hpf表達信號減弱，持續至72.00 hpf。El-Kadi等[20]在爪蟾的研究中發現，Rap1在神經板(背部外胚層)、神經管等神經系統高表達。結合本研究結果，提示在脊椎動物，Rap1在神經系統的表達模式具有高度保守性，并且可能參與調控斑馬魚胚胎脊索神經系統的早期發育過程。

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Spatiotemporal expression spectrum of Rap1 gene in zebrafish early development process*

YangXiaoyan1,HeZhixu1,2△,ShuLiping2，3,JinJiao1,HuangJing1,WuSasa1,MaJianjuan1

(1.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;2.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,AffiliatedHospitalofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 3.TeachingandResearchingSectionofImmunology，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To choose zebrafish as the experimental animal model for studying the spatiotemporal expression rule of rap1 gen in zebrafish embryo early development process.MethodsThe Rap1 gene fragment was cloned from the zebrafish embyoscDNA,then the Rap1 gene fragment and pCS2+ plasmid were performed the in vitro connetion and recombination was extracted,the combinant plasmid was correct after the double enzyme digestion,colony PCR and sequencing identification.T3 RNA polymerase in vitro transcription system was used to obtain the digoxin(DIG)-labeled anti-sense mRNA probe of Rap1 gene.The whole mount in situ hybridization method was adopted to detect the Rap1 expression in zebrafish embryo early development process.ResultsThe positive hybridization signal of Rap1 gene was detected at the cell division junction region of 0.75 hpf,animal pole of 3.70 hpf and 6.00 hpf,and notochord of 12.00-72.00 hpf.ConclusionRap1 gene might be involved in the early development process of notochord nervous system in zebrafish.

Rap1 gene;zebrafish;in situ hybridization;gene expression

國家自然科學基金面上項目(30960412)；貴州省科技基礎條件平臺項目([2009]4005)；貴州省優秀教育人才省長專項資金($2008-4)。作者簡介：楊小燕(1986-)，主治醫師，碩士，主要從事小兒血液系統方面的研究。△

,E-mail：hzxmedical@163.com。

Q132.4

A

1671-8348(2016)20-2748-04

2015-12-13

2016-02-28)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.004