蟾酥的高效液相指紋圖譜研究*

姬　誠　郭萬周

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【實驗研究】

蟾酥的高效液相指紋圖譜研究*

姬誠郭萬周

南陽醫學高等專科學校(南陽 473061)

摘要：目的建立評價蟾酥飲片質量優劣的指紋圖譜分析方法。方法采用高效液相色譜法，Allitma 反相C18色譜柱(250mm×4.6mm，5.0μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，檢測波長為296nm，流速0.7ml/min，柱溫為30℃。用指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度。結果該方法精密度、重現性、穩定性和各共有峰相對保留時間RSD均小于5%，各產地樣品的相似度大于95%。結論用蟾酥高效液相指紋圖譜分析法，可較全面地反映蟾酥飲片的內在質量，可用于蟾酥飲片的質量控制。

關鍵詞：蟾酥；高效液相色譜法；指紋圖譜

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物。性溫、味辛，有毒，歸心經，具有解毒、消腫、止痛、開竅醒神之功效，主要用于治療癰疽疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、牙痛、痧脹腹痛和神昏吐瀉等癥[1,2]。現代藥理學研究表明：蟾酥具有強心、升壓、抗腫瘤、抗心肌缺血等功效[3]。

本文采用高效液相色譜法建立了蟾酥藥材的指紋圖譜，并標定出8個共有指紋峰，同時對其指紋圖譜進行相似度評價，為蟾酥藥材的質量標準的建立及其質量控制提供依據[4,5]。

1　儀器與試藥

Agilent-1200 高效液相色譜儀；1200VWD紫外檢測器;AgilentLC工作站;Milli-Q超純水機；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A,國家藥典委員會)。12批蟾酥藥材(見表1)購自山東、江蘇以及四川省的不同地區，經鑒定均為中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥分泌物。色譜純乙腈 (Fisher公司);分析純甲酸(北京第二化工廠)。

對照品華蟾酥毒基、脂蟾毒配基購自中國藥品生物制品檢定所，蟾毒靈、蟾毒它靈對照品購自上海鼎瑞化工有限公司，日蟾毒它靈對照品購自南昌貝塔生物科技有限公司，沙蟾毒精、遠華蟾毒精對照品購自江西本草科技有限責任公司。

2　方法

2.1色譜條件色譜柱：GraceAllitmaC18(4.6mm× 250mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15min，A為30%～62%；15～30min，A為62%)；檢測波長：296nm；柱溫：30 ℃；流速：0.7ml/min；進樣量：20μL。

2.2對照品溶液的制備精密稱取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、日蟾毒它靈、蟾毒它靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精對照品適量，加甲醇溶解，作為對照品溶液，濃度分別為華蟾酥毒基0.952mg/mL、脂蟾毒配基0.696mg/mL、蟾毒靈0.266mg/mL、日蟾毒它靈0.224mg/mL、蟾毒它靈0.344mg/mL、沙蟾毒精0.232mg/mL、遠華蟾毒精0.104mg/mL。再各精密吸取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過后作為混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取各地產蟾酥藥材細粉0.1g，精密稱定，加入甲醇20ml，超聲處理60min，放冷，定容至25mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.4方法學考察

2.4.1精密度試驗分別精密吸取同一供試品溶液。連續進樣5次，按上述方法色譜條件測定。計算各峰峰面積RSD值<1% 表明該方法精密度良好。

2.4.2穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液。分別在0、2、4、8、12、24h時進樣，按上述方法色譜條件測定。計算各峰峰面積RSD值<1%，表明該供試品溶液在24h內穩定。

2.4.3重復性試驗取同一批蟾酥藥材按供試品制備方法制備供試品溶液5份，測定HPLC色譜圖。計算各峰峰面積RSD值<3% 表明該方法重復性良好。

2.5蟾酥藥材指紋圖譜的建立取蟾酥藥材樣品12批，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別進樣20ul，記錄色譜圖(圖1)。結果12批藥材有8個特征指紋峰，其中7號峰為華蟾酥毒基，1號峰為日蟾毒它靈，2號峰為沙蟾蜍精，3號峰為遠華蟾毒精，4號峰為蟾毒它靈，6號峰為蟾毒靈，8號峰為脂蟾毒配基，以華蟾酥毒基的保留時間為參照，計算各產地藥材共有指紋峰的相對保留時間的差異，結果RSD均小于5%。

圖1　不同產地蟾酥的HPLC指紋圖譜

2.6相似度計算指紋圖譜相似度評價采用國家藥典委員會開發的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版(2004A)進行計算。首先將色譜工作站數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，以中位數法產生對照指紋圖譜，分別計算不同批次的樣品與對照圖譜之間的相似度。12批蟾酥藥材的相似度結果見表1。

表1　蟾酥藥品來源及相似度計算結果

3　討論

在預試驗中，對比了不同濃度甲醇、乙醇，超聲提取、加熱回流、冷浸提取等不同提取方法對蟾酥指紋圖譜的影響，結果表明，甲醇超聲提取所得圖譜指紋峰比較豐富，并且操作簡單。另外，課題組也比較了甲醇-水、乙腈-水以及不同比例的乙腈-水-甲酸、乙腈-水-乙酸等多種流動相的梯度洗脫效果，結果表明，選用乙腈-0.01%甲酸水溶液系統以合適的梯度洗脫所得指紋圖譜分離效果和峰型最好。全波長掃描發現在296nm處有蟾酥毒基類成分的最大吸收，綜合考慮選定296nm為檢測波長。本實驗建立了蟾酥藥材的指紋圖譜，確立了8個共有峰，導入中國藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件，結果12批樣品指紋圖譜的相似度均在 95.6% 以上，相似度較好，可用于蟾酥藥材的定性質量評價，為蟾酥及其制劑質量標準的制定提供補充。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2015：383.

[2]高學敏.中藥學[M].北京：中國中醫藥出版社,2007:512-513.

[3]鞏麗麗,李景香,張會敏.蟾酥藥理作用及制劑工藝的研究進展[J].食品與藥品，2007,9(10)：51-53.

[4]石玉娟,解軍,李桂蘭.山西省不同產地中藥材黃芪HPLC指紋圖譜研究[J].光明中醫,2010,25(5):790-791.

[5]陳紅,程再興,肖永慶. 炮制前后梔子飲片HPLC指紋圖譜比較研究[J].光明中醫,2009,24(6)：1044-1055.

*基金項目：河南省南陽市科技攻關項目(No.2015KJGG08)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.12.021

文章編號：1003-8914(2016)-12-1727-03

收稿日期：(本文校對：賈荷麗2015-11-27)

Study on the High Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Venenum Bufonis

JI ChengGUO Wanzhou

(Nanyang Medical College, Henan, Nanyang 473061, China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC-fingerprint method for evaluating the quality of Venenum Bufonis medicinal slices. MethodsThe separation was performed on the Allitma C18 column (250mm×4.6mm, 5.0μm) with the gradient elution of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as the mobile phase at the rate of 0.7 mL/min. The detection wavelength was 296 nm, and the column temperature was 30℃. The similarity was calculated by fingerprint similarity evaluation software. ResultsThe RSD of precision, reproducibility and stability for this method were less than 5%. The similarity of these samples was more than 95%. ConclusionThe HPLC fingerprint can comprehensively reflect the inner quality of Venenum Bufonis medicinal slices, and can be used to control its quality.

Key words：Venenum Bufonis; HPLC; Fingerprint