人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在宮頸癌篩查中的意義

張永欣，張　璐

(煙臺市煙臺山醫院婦科，山東 煙臺 264001)

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人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在宮頸癌篩查中的意義

張永欣，張璐

(煙臺市煙臺山醫院婦科，山東 煙臺 264001)

[摘要]目的評估人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7mRNA檢測在宮頸癌篩查中的意義。方法對3 381名行機會性宮頸癌篩查的女性分別行液基細胞學(TCT)、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢查，其中371例結果可疑者行陰道鏡下活檢。分別記錄其TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢測結果及活檢病理結果等，采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。結果人群篩查中HPV E6/E7mRNA的總陽性率為16.47%(557/3 381)；炎癥患者與宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ級患者HPV E6/E7mRNA的陽性率分別為60.73%(116/191)和68.60%(83/121)，差異無統計學意義(F=1.98，P>0.05)；炎癥患者與CIN Ⅰ級患者mRNA表達量分別為7 781.26±2 686.13和7 498.47±2 860.08 copy/mL，亦無顯著差異(t=0.07，P>0.05)，而CIN Ⅱ-Ⅲ級患者HPV E6/E7mRNA的陽性率為89.10%(49/55)，mRNA表達量為30 716.66±10 281.89，均顯著高于炎癥患者(χ2=15.55，t=2.19)及CIN Ⅰ患者(χ2=8.47，t=2.18)，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同活檢病理分級(≤CIN Ⅰ或≥CIN Ⅱ)中，只有HPV E6/E7mRNA的檢測結果有顯著性差異(χ2=15.45，P<0.05)；對于宮頸CIN Ⅱ以上病變的診斷，HPV E6/E7mRNA的敏感度最高(89.83%)；TCT特異度最高(62.18%)。HPV E6/E7mRNA最佳工作點為1 637.48copy/mL，其診斷宮頸高級別上皮內瘤變的敏感度為79.70%，特異度為63.50%。ROC曲線下面積為0.75(P<0.05)。結論HPV E6/E7mRNA檢測診斷宮頸高級別上皮內瘤變具有較高的敏感性和特異性，在宮頸癌篩查具有較為重要的意義。

[關鍵詞]人乳頭瘤病毒；E6/E7mRNA；宮頸上皮內瘤變；宮頸癌篩查

在我國，宮頸癌仍是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤[1]。目前，宮頸癌篩查方法眾多，如何利用有效的醫療資源最大限度的減少宮頸癌的發生是目前臨床蒞待解決的問題。眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續感染是宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN))發生的重要原因，也是CIN進展為宮頸癌的重要因素[2]。已有很多研究證實，發生HPV感染后，隨著宮頸病變的加重，HPV E6/E7mRNA的陽性率也隨之增加[3-4]。本文通過對HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸癌篩查中的應用進行前瞻性研究，并與另外兩種最常見的宮頸癌篩查方法進行對照分析，以期尋找最佳的宮頸癌篩查方案，從而最大程度地減少醫療資源浪費并提高宮頸癌的篩查效率。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2013年7月至2015年6月在煙臺市煙臺山醫院婦科門診或婦科病房行機會性宮頸癌篩查的女性，排除既往曾接受過治療的CIN或宮頸癌患者、妊娠患者、患惡性、自身免疫疾病或正在接受免疫抑制治療的患者，對3天內無性生活、未行陰道上藥/沖洗的患者，分別行液基細胞學(thinprep cytologic test，TCT)、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢查。

滿足如下任意條件的患者均在知情同意下行陰道鏡下活檢：①任何TCT結果為不能明確意義的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)及以上的患者；②HPV DNA分型檢測提示為16型或18型感染的患者；③HPV DNA分型檢測提示為其它高危亞型感染持續1年以上陽性的患者；④TCT和高危型HPV DNA分型檢測為陰性但HPV E6/E7mRNA持續半年以上陽性的患者。

記錄每一個研究對象年齡、TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢測結果及采樣時間，活檢前陰道鏡診斷，活檢及環形電切術(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)病理結果及操作時間等。

1.2研究方法

1.2.1標本制備

采用新柏氏專用宮頸取樣毛刷，緊貼宮頸口略微用力并順時針旋轉7～8圈，充分留取宮頸管內和鱗柱上皮交界處的宮頸脫落細胞，將刷頭放入專用細胞保存液中于4℃保存、1周內檢測。

1.2.2各項指標檢測

TCT采用全自動液基細胞離心制片機(美國新柏氏)進行制片，染色后鏡檢；HPV DNA采用廣東凱普生物科技股份有限公司的人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型檢測試劑盒將TCT檢查剩余的1/2標本液(1號液)進行HPV檢測及基因分型；HPV E6/E7mRNA采用科蒂亞(新鄉)生物技術有限公司的宮頸穩態檢測專用試劑盒通過信號擴增法對TCT檢查剩余的另外1/2標本液(2號液)進行定量檢測。所有檢測均在不知曉其它檢測結果的前提下按照試劑盒說明進行操作。

1.2.3病理學檢查

陰道鏡下活檢由經驗豐富的中、高年資醫師完成。活檢病理結果根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)分類和診斷標準分為：陰性、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和微小浸潤癌。所有宮頸活檢病理結果均采用雙盲法由2個有經驗的病理科醫生共同確定，若診斷不一致，則由兩位病理醫師在雙頭鏡下達成共識。

1.3統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。分別統計不同病理級別中，TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA的檢測結果，用卡方檢驗分析不同病理級別TCT、HPV DNA分型及HPV E6/E7mRNA的陽性率有無差別，比較不同篩查方法對于宮頸高級別上皮內病變的診斷的敏感度和特異度。通過繪制ROC曲線得知HPV E6/E7mRNA定量的最佳臨界值，并進一步評價其敏感性和特異性。

2結果

2.1人群篩查情況

共有3 381名進行機會性宮頸癌篩查的女性入組，年齡20～73歲，平均年齡31.24±9.67歲。其中HPV E6/E7mRNA的總陽性率為16.47%(557/3 381)，HPV E6/E7mRNA定量值<1 000的有184例，定量值1 000～3 000的有176例，定量值3 000～10 000的有128例，定量值≥10 000的有69例。TCT的陽性率(ASCUS及以上)為4.20%(142/3 381)。HPV DNA檢測高危亞型感染率為23.63%(799/3 381)，其中178例存在HPV16型或18型感染，127例為其它高危亞型感染且持續陽性1年以上。36例TCT和高危型HPV DNA分型檢測為陰性，但HPV E6/E7mRNA持續陽性半年以上。

2.2不同級別宮頸病變HPV E6/E7mRNA表達情況

371例患者接受陰道鏡下活檢，年齡20～66歲，平均年齡38.25±10.42歲。比較炎癥患者與CIN Ⅰ患者HPV E6/E7mRNA的陽性率(χ2=1.98)和mRNA表達量(t=0.07)均無顯著差異(P>0.05)，而CIN Ⅱ-Ⅲ患者HPV E6/E7mRNA的陽性率和mRNA表達量均顯著高于炎癥患者(χ2=15.55，t=2.19)及CIN1患者(χ2=8.47，t=2.18)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

注：▲為炎癥患者與CINⅠ患者比較，★為CIN Ⅱ-Ⅲ與炎癥患者比較，◆為CIN Ⅱ-Ⅲ與CIN Ⅰ患者比較。

2.3 HPV E6/E7mRNA表達與TCT及HPV分型檢測結果比較

371例活檢病人中，有142例是TCT陽性患者，其中67.61%(96/142)HPV E6/E7mRNA陽性；305例HPV DNA分型檢查為高危型陽性的患者有67.87%(207/305)HPV E6/E7mRNA陽性。其與宮頸活檢病理結果的關系見表2，不同活檢病理分級(≤CIN I或≥CIN II)只有HPV mRNA的檢測結果有顯著性差異。3種篩查方法對于宮頸CIN II以上病變的診斷，敏感度:HPV mRNA較HPV DNA檢測略高，TCT最差；特異度：TCT最佳；HPV mRNA次之，HPV DNA最差，見表3。

2.4 ROC曲線分析

以組織病理學結果為金標準，≥CIN II者為陽性，

表2不同篩查方法檢測結果與宮頸活檢病理結果的關系[n(%)]

Table 2　The relationship between the detection results of different screening methods and the pathological results of cervical biopsy[n(%)]

表3不同篩查方法對于宮頸高級別上皮內瘤變的診斷的敏感度和特異度比較

Table 3Comparison of the sensitivity and specificity of different screening methods in the diagnosis of CIN

篩查方法敏感度(%)特異度(%)TCT40.6762.18HPVDNA88.1418.91HPVmRNA89.8336.22

圖1HPV E6/E7mRNA診斷宮頸高級別上皮內病變的ROC曲線

Fig.1The ROC curve of HPV E6/E7 mRNA test in the diagnosis of high grade CIN

3討論

3.1 HPV E6/E7mRNA表達與宮頸病變病理分級的關系

眾所周知，高危型HPV持續感染是宮頸癌發生和發展的首要因素，99.7%的宮頸癌標本中均可檢測到HPV。HPV基因編碼包括6個早期開放讀碼框(E1、E2、E3、E5、E6和E7)和2個晚期讀碼框(L1和L2)。大量研究已證實，HPV早期讀碼框中的E6/E7基因才是導致女性罹患宮頸癌的主要原因。發生高危型HPV感染后，病毒DNA一旦與宿主細胞DNA整合，其病毒的主要致癌基因E6、E7將不受控制地高度表達，產生E6、E7癌蛋白，然后與宿主細胞的一些細胞周期調節蛋白結合，導致細胞周期調節失控，進而發生癌變。由于DNA攜帶的遺傳信息需轉錄給mRNA后再翻譯成蛋白質，因此通過測定癌基因轉錄產物mRNA的量，可以直接反映癌基因的活性，達到檢測蛋白質表達的目的[5-6]。當前HPV的分子診斷方法主要依賴于對HPV DNA的檢測。自2003年美國食品與藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)就批準將HPV DNA檢測聯合細胞學檢查用于30歲以上女性的宮頸癌篩查。這種聯合篩查方式顯著降低了宮頸癌的發生率。然而，事實上只有很少一部分HPV感染會導致宮頸癌或宮頸癌前病變。HPV DNA檢測作為病因檢測，無法對病毒感染階段及病毒致癌活性進行判斷，其作為宮頸癌篩查手段敏感度高但特異度低，造成很大程度的過度檢查和過度治療，這個現象在HPV感染較常見的30歲以下的年輕女性中尤為常見，且危害更大[7]。因此，臨床迫切需要一種更特異的生物標記物。目前，很多學者已將研究重點轉到宮頸癌及癌前病變中高危型HPV E6/E7mRNA的表達，已知HPV E6/E7mRNA在宮頸癌及癌前病變中陽性率明顯升高，但其表達情況與不同CIN病理分級的關系尚無定論。

本研究中炎癥病變和CIN Ⅰ病變中HPV E6/E7mRNA的陽性率分別為60.73%和68.60%，mRNA表達量平均值分別為7 781.26copy/mL和7 498.47copy/mL；而CIN Ⅱ-Ⅲ和宮頸浸潤癌的患者中，HPV E6/E7mRNA的陽性率分別為89.10%和100.00%，mRNA表達量平均值分別為30 716copy/mL和 6 649.05copy/mL，可見在宮頸病變的進展過程中，其mRNA的量在進入高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)階段會有明顯的升高，進入浸潤癌階段卻有明顯回落趨勢，由于本研究中宮頸浸潤癌的病例較少，二者的差異無統計學意義，具體機制也有待進一步研究。但HPV E6/E7mRNA檢測對于宮頸高級別鱗狀上皮內瘤變的診斷無疑有非常重要的意義。

3.2宮頸癌篩查中不同檢查方法的意義比較

綜合比較TCT、HPV DNA和HPV E6/E7mRNA，對于宮頸高級別鱗狀上皮內病變及宮頸癌的診斷，HPV E6/E7mRNA診斷的靈敏度略高于HPV DNA，特異度也明顯高于HPV DNA，與既往研究相近[3-4]。尤其是利用ROC曲線分析后，以HPV E6/E7mRNA表達量1 637.48copy/mL作為臨界值，診斷宮頸高級別病變敏感度為79.70%，略降低，但特異度明顯升高，達63.50%，超過TCT檢測的特異度。另外，本研究還發現36例TCT和高危型HPV DNA分型檢測為陰性，但HPV E6/E7mRNA持續陽性半年以上的患者，有15例活檢病理分級在HSIL以上，在臨床中我們應對這部分病人予以充分重視。

綜上所述，HPV E6/E7mRNA可有效地提高宮頸癌篩查的敏感性和特異性，從而減少過度檢查和過度治療，也能明顯減輕病人的心理負擔，尤其對于年輕女性的宮頸癌篩查具有非常重要的意義。

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[專業責任編輯：張忠明]

[收稿日期]2016-04-27

[基金項目]煙臺市科技計劃資助項目(項目編號：2015YD008)

[作者簡介]張永欣(1966-)，女，副主任醫師，主要從事宮頸病變研究。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.010

[中圖分類號]R711.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)07-0816-03

Significance of human papillomavirus E6/E7mRNA detection in cervical cancer screening

ZHANG Yong-xin, ZHANG Lu

(Department of Gynecology, Yantaishan Hospital, Shandong Yantai 264001, China)

[Abstract]Objective To evaluate the significance of human papillomavirus (HPV) E6/E7mRNA detection in cervical cancer screening. Methods A total of 3 381 women who had taken an opportunistic cervical cancer screening received thin-prep cytologic test (TCT), HPV DNA and HPV E6/E7mRNA examinations. Among them, 371 cases with suspicious results underwent colposcopy guided biopsy. The results of their TCT, HPV DNA and HPVE6/E7mRNA tests and the pathologic results were recorded and analyzed by SPSS19.0 software. Results The total positive rate of the HPV E6/E7mRNA test was 16.47% (557/3 381). The positive rate of HPV E6/E7mRNA in patients with inflammation and cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ(CIN Ⅰ) was 60.73% (116/191) and 68.60% (83/121), respectively. The difference was not significant (F=1.98, P>0.05). The mRNA expression levels of patients with inflammation and patients with CIN Ⅰ was 7 781.26±2 686.13 and 7 498.47±2 860.08 copy/mL, respectively. The difference was also not significant (t=0.07, P>0.05). However, the positive rate and mRNA expression levels of CIN Ⅱ-Ⅲ patients (89.10% [49/55]; 30 716.66±10 281.89 copy/mL) were significantly higher than those of patients with inflammation (χ2=15.55, t=2.19) and CIN Ⅰ patients (χ2=8.47, t=2.18). The differences were all statistically significant (all P<0.05). Only HPV E6/E7mRNA test results were significantly different (χ2=15.45,P<0.05) in patients with different biopsy grade (≤CIN Ⅰ or ≥CIN Ⅱ). HPV E6/E7mRNA showed its highest sensitivity (89.83%) while TCT had the highest specificity (62.18%) in the diagnosis of CIN Ⅱ and above. The optimal operating point of HPV E6/E7mRNA was 1 637.48copy/mL. The sensitivity in diagnosing high degree of CIN lesions was 79.70% and the specificity was 63.50%. The area under ROC curve was 0.75 (P<0.05).Conclusion HPV E6/E7mRNA test can detect and diagnose CIN lesions with relatively high sensitivity and specificity. Thus, it has important significance in cervical cancer screening.

[Key words]human papilloma virus (HPV); E6/E7mRNA; cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical cancer screening