血小板線粒體調節肺毛細血管屏障功能的實驗研究

唐昊　祁海峰　王耀麗　楊雪飛　李鵬飛　雷洋　張鵬　周健

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血小板線粒體調節肺毛細血管屏障功能的實驗研究

唐昊祁海峰王耀麗楊雪飛李鵬飛雷洋張鵬周健

400042 重慶， 第三軍醫大學大坪醫院重癥醫學科

【摘要】目的探討血小板線粒體對肺損傷(ALI)時肺毛細血管通透性的調節作用。方法建立鹽酸(pH 1.2, 1.5 ml/kg)誘發的急性肺損傷動物模型，通過肺毛細血管濾過系數、流式細胞儀檢測、共聚焦顯微鏡方法，觀察血小板線粒體對鹽酸致急性肺損傷形成中肺毛細血管屏障功能的影響。結果與正常組比較，鹽酸致肺損傷模型中肺毛細血管濾過系數增高2.5倍(n=4,P<0.05)，滅活血小板線粒體后，肺毛細血管濾過系數增高5倍(n=4,P<0.05)。流式細胞儀分析血小板線粒體轉移到白細胞中；共聚焦顯微鏡發現，血小板與中性粒細胞相互作用促進肺損傷。結論抑制血小板線粒體功能增加鹽酸誘導的肺損傷，肺血管內皮屏障依賴于血小板線粒體的功能，線粒體從血小板傳遞給白細胞可導致增加白細胞粘附到損傷的微血管內皮。

【關鍵詞】急性肺損傷；血小板；肺微血管屏障功能；線粒體

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和/或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是重癥醫學科臨床常見的疾病[1-3]。ARDS的臨床特征為難治性低氧血癥和進行性呼吸窘迫，其主要病理變化為肺不張、形成透明膜、肺水腫，以通透性增強、肺毛細血管彌漫性損傷為基礎。據國內外臨床醫學統計，其病死率在50%以上，該病預后極差、發展迅猛、起病急驟[4-6]。近年研究發現，血小板與ARDS的發病密切相關[7-12]。一方面，ARDS促進血小板的活化，ARDS時，血小板在數量、結構、功能、生化等方面都會發生改變；另一方面，血小板促進ARDS的發病過程，ARDS時，活化的血小板沉積在受損的肺微血管系統內，有助于引發和加劇肺泡損傷；血小板與白細胞、內皮細胞、細胞因子相互作用促進ARDS的發病，也可通過多種信號轉導途徑促進ARDS的發病。為此，我們對血小板線粒體在鹽酸致肺損傷模型中調節肺毛細血管通透性的作用進行實驗研究，旨在為探討ALI中血小板和內皮細胞、中性粒細胞的相互作用提供理論依據和實驗基礎。

材料與方法

一、實驗材料

選擇健康清潔級雄性小鼠(8～12 周齡，C57BL/6,體質量 20～25 g，由哥倫比亞醫學實驗動物中心提供)，CD41、CD45和VE-鈣黏素等免疫熒光抗體均購自重慶賽奧生物生物技術有限公司；大鼠抗小鼠的CD144 (VE-cadherin)抗體，大鼠抗小鼠的CD41-FITC, 大鼠抗小鼠的CD45 PE抗體均購自eBioscience公司, 肺毛細血管濾過系數測定實驗儀器和軟件，共聚焦顯微鏡儀器和分析軟件，由哥倫比亞醫學中心Jahar實驗室提供。

二、實驗動物分組

用完全隨機方法將實驗動物小鼠60只分為兩組，每組30只。①生理鹽水對照組(control group)；②鹽酸誘發ALI組(acid-induced acute lung injury group)。小鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉，然后用 1 mol/L HCl(2 μl/g, pH=1.5)經鼻滴入氣管內復制動物模型，于灌注后第 2 h處死，留取血清，右肺組織用 10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，左肺于-80 ℃液氮中保存備用。用免疫組化法測定肺組織中纖維蛋白含量，通過病理切片HE染色及天狼星紅染色觀察肺組織膠原纖維沉積情況；用離體肺進行體外肺毛細血管濾過系數的測定及共聚焦顯微鏡觀察。

三、檢測指標與方法

參照文獻[10-11]報道的方法，建立了離體血液灌注鼠肺的準備，保持肺動脈壓、左心房壓、氣道壓力分別在12， 3和5 cmH2O，以恒定的血流量(0.5 ml/min)，流量(0.5 ml/min，37 ℃)；灌輸生理鹽水或鹽酸至氣管內，獲得過濾系數后1 h，利用小鼠離體肺灌流模型,采用肺重量分析法測定肺毛細血管濾過系數 (Kf); 用EDT法，4 ℃條件下，新鮮分離肺微血管內細胞，免疫染色后，應用流式細胞儀進行檢測和分析，進一步封片用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白CD41、CD45和VE-鈣黏素等的表達;用 EDT法，4 ℃條件下，分離肺微血管內皮細胞，進一步用抗體 IκBα、TF、vWF、VE-鈣黏素和 P-選擇素免疫熒光染色，應用流式細胞儀進行檢測和分析不同抗體在不同細胞上的表達，封片并用適時激光共聚焦顯微鏡觀察其在細胞中的表達及定位。

四、統計學方法

結　　果

一、血小板灌注對肺微血管濾過系數的影響

正常對照組基線Kf是0.22±0.04 ml/(cmH2O·min·100 g wet lung weight)。鹽酸滴注氣道后，Kf是對照組的2.5倍，說明微血管損傷。魚藤酮治療的血小板組Kf升幅5倍，而未經處理的血小板組，Kf升幅2.5倍。魚藤酮治療血小板增加肺損傷。由此，抑制血小板線粒體功能會增加肺微血管濾過系數，見圖1。

二、魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉移的影響

為了探討血小板轉移線粒體的可能性，確定了血小板特異性蛋白作為標志物，CD41和線粒體黛(綠色)。我們標記分離的細胞為血小板用CD41(α2B，Ⅱb / Ⅲa受體復合物)，血小板線粒體黛綠色，在控制血小板數量的條件下，對照組血小板表達CD41和MTG的數量少，魚藤酮提高血小板表達CD41和MTG的數量，表明血小板線粒體被轉移到其他的血小板。流式細胞技術檢測顯示，線粒體從對魚藤酮中毒血小板朝著健康的血小板遷移，見圖2。

圖2　魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉移的影響

三、線粒體從血小板轉移到白細胞

鹽酸誘導肺微血管的適時肺成像，肺微血管被灌注入紅色熒光鈣黃綠素紅(5 μM，20 min，藍)，血小板表達DsRed的(紅)和白細胞表達鈣黃綠素綠(綠色)。共聚焦顯微鏡呈像表示血小板白細胞共定位。從血小板線粒體轉移到白細胞導致增加白細胞粘附到受傷的肺微血管。紅色和綠色熒光的共定位是由黃色在微血管白細胞呈現的,見圖3。

討　　論

研究證明，線粒體從血小板轉移到白細胞導致白細胞黏附到受損微血管的數量增加，抑制血小板線粒體電子傳遞可使肺微血管滲透性增加。在鹽酸引起的肺損傷模型實驗中，血小板可促進肺泡毛細血管內膜損傷，造成滲透性肺水腫。通過本實驗，推測激活的血小板介導的ALI可能通過包括聚合、 介質的釋放，以及內皮細胞的信號傳導，并與多形核白細胞和單核細胞，共同引發或擴增了炎性損傷的相互作用的機制，這種相互作用可能是基于血小板線粒體的功能。線粒體不僅是必需的，而且在大多數的細胞中作為供能以穩定內環境。該細胞器還通過產生活性氧調節胞內的信號，并通過細胞色素C的釋放引發細胞凋亡。在小鼠鹽酸引起的肺損傷模型中，與對照組相比，線粒體從血小板轉移到白細胞導致白細胞黏附于微血管的數量增加，從而導致肺損傷。

圖1抑制血小板線粒體功能增加肺微血管濾過系數

圖3魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉移的影響

這些發現證實了急性肺損傷相關的血管功能障礙機制，血小板可增強內皮細胞促凝血蛋白表達，可能原因是酸性損傷增加了CD45片段的VE-鈣黏附分子上血小板蛋白CD41和CD42b的表達，指示血小板蛋白轉移到內皮。蛋白表達的原因是因為細胞上的游離血小板來源的蛋白增強了內皮促凝血反應[13-18]。肺的炎癥損傷通過內皮表面血小板衍生蛋白的沉積引起促凝血表型在肺部的表達。本研究同時支持一個新的關于組織因子(tissue factor, TF)出現在內皮表面的機制[4]。對于TF大多數的理解來源于體循環，主要是基于TF通過纖維母細胞，血管平滑肌細胞和周細胞表達。病理狀態下，例如膿毒癥，TF可在單核細胞和人血小板中表達[8-10]。酸性物質損傷內皮表面表達的TF可能不是來源于血管平滑肌，而完全來源于血小板。內皮表達的CD41和CD42b的酸性損傷證實來源于血小板的蛋白具有體外活性[9]，這種變化的發生是內皮游離血小板持續黏附和脫離的結果。此外，這些血小板表達中對酸性損傷的增強是血小板內皮通過肺血管表面與構成VE鈣黏蛋白在肺血管表面廣泛的區域相互作用的證據[11-12]。既然活化的血小板釋放了CD41+和CD42b+微粒，很可能血小板微粒在蛋白轉移中發揮了作用。在最小程度上，白細胞也有助于TF在內皮細胞上的表達。肺損傷時，內皮血小板決定血管內皮的促炎-抗凝表型的形成。肺損傷中血小板的作用大多數認為對白細胞起激活作用[9-13]。

本研究結果顯示，線粒體從血小板轉移到白細胞。循環中的血小板含有少數具有完整功能的線粒體。越來越多的證據顯示，這些線粒體不僅通過產生能量而且通過氧化還原反應和細胞凋亡的啟動，調節血小板形成血栓的功能[2，4，10]。除了止血的調節，傳統認為血小板的作用可作為識別和研究人類線粒體功能障礙性疾病，因為與其他代謝活躍的組織相比血小板容易獲取。生理狀態下，血小板通過循環接近內皮，但是血液流動以及抗凝物質可防止血小板黏附形成血栓。然而當血管損傷時，血小板開始通過快速以及復雜的信號通路，加快三級放大的凝血反應[4, 7-9]。第一步，血小板通過特殊的表面受體相互作用與暴露的內皮下因子(例如von Willebrand 因子、膠原蛋白、血小板反應蛋白和層連蛋白)一起黏附至受損的內皮；第二步，血小板的聚合，主要通過血小板表面的G蛋白耦聯受體捆綁的ADP和凝血酶調節，從而啟動了細胞的一系列信號放大反應。這些信號級聯反應，包括磷脂酶C的抑制，磷脂酰肌醇三激酶的活化，主要引起血小板的變形以及其他血小板的活化和黏附。最后第三步，血小板釋放包括來自血小板顆粒的ADP在內的可溶性因子和表達性炎癥介質。此外表面糖蛋白Iib/IIIa的表達增加了血小板的間接聚合，最后形成血栓[1，3]。

線粒體從血小板轉移到白細胞為一種新的ALI/ARDS的調節途徑，血小板的激活和聚集在急性呼吸窘迫綜合征發病中起著重要的作用，血小板與內皮細胞相互作用促進肺損傷，研究結果表明，線粒體與血小板活化和凋亡的調節相關[15-16]。越來越多的證據表明血小板活化增強、線粒體超極化和ROS產生，均參與肺損傷。許多研究表明，血小板數量減少及血小板功能受損，同樣會引起不同程度的肺損傷[17-19]。已有研究表明，線粒體從骨髓基質干細胞轉移至肺泡上皮細胞，可增加肺泡的ATP，從而起到保護肺的作用[11]。

綜上所述，血小板不僅在血栓形成中起作用，同樣在炎癥的發生發展中起著重要作用，血小板活化、內皮損傷和纖維蛋白原之間相互作用參與了ARDS過程，而且可能是主要的致病因素之一。血小板與ARDS發病的關系十分復雜。在ARDS時，血小板本身既是受損靶細胞，又可通過自身結構和功能的改變加速ARDS的進程。有針對性的進行抗血小板治療，有望改變ALI/ARDS的自然病程。

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(本文編輯：黃紅稷)

唐昊，祁海峰，王耀麗，等. 血小板線粒體調節肺毛細血管屏障功能的實驗研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 258-262.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.005

基金項目:國家自然科學基金青年資助項目(81200057)

通訊作者：王耀麗，Email: wangylchen2005@aliyun.com

中圖法分類號：R563.1

文獻標識碼：A

Corresponding author：Wang Yaoli, Email: wangylchen2005@aliyun.com

(收稿日期：2016-01-21)

Platelet mitochondria modulate lung microvascular barrier function in acid-induced lung injury

TangHao,QiHaifeng,WangYaoli,YangXuefei,LiPengfei,LeiYang,ZhangPeng,ZhouJian.Desect1mentofCriticalCareMedicine,DapingHospital,ResearchInstituteofSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400042,China

【Abstract】ObjectiveTo determine the role of platelet mitochondria in lung microvascular barrier regulation in the mouse model of acid-induced acute lung injury(ALI). MethodsTo induce ALI, HCl (pH 1.2, 1.5 ml/kg) was used in the isolated mouse lungs by airway instillation. After 1 h, it was determined the microvascular filtration coefficient (Kf) to quantify lung microvascular barrier properties. pulmonary vascular cells were isolated for flow cytometry and confocal microscopy to detect the role of platelet mitochondria in lung microvascular barrier regulation in the mouse model of acid-induced ALI. ResultsAcid instillation increased Kf 2.5-fold above baseline (n=4, P<0.05), indicating that acid instillation caused major microvascular injury. In isolated mouse lung perfused with rotenone-treated platelets, acid instillation increased Kf 5-fold above baseline (n=4, P<0.05). The presence of platelet mitochondria in the leukocyte was evident optically, as well as by the flow cytometry and confocal microscopy. ConclusionsInhibiting platelet mitochondrial function increases lung injury in the acid-aspiration model of ALI. Lung endothelial barrier protection depends on functioning platelet mitochondria. The mitochondrial transfer from platelet to leukocyte resulted in increased leukocyte adhesion to injuried microvessel.

【Key words】Acute lung injury;Platelet;Lung microvascular barrier function;Mitochondria