miR-202調控GLI-2干預肺癌A549細胞的增殖和凋亡

楊麗　王霞　楊永靜　羅莉　李長桂　孫曉容　胡明冬

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miR-202調控GLI-2干預肺癌A549細胞的增殖和凋亡

楊麗王霞楊永靜羅莉李長桂孫曉容胡明冬

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸內科

【摘要】目的探討miR-202對肺癌A549細胞增殖和凋亡的調控作用及其相關機制。方法培養(yǎng)肺腺癌A549細胞和肺正常上皮BEAS-2B細胞，利用Real time-PCR檢測miR-202在上述細胞中的表達水平；合成并將miR-202 minic和miR-NC轉染進入A549細胞后，應用MTT檢測12、24、48 h時細胞的抑制率，使用流式細胞術檢測轉染后48 h細胞的凋亡情況，利用western blot檢測GLI-2蛋白的表達情況；構建野生型和突變型GLI-2 3′UTR 插入pMIR-REPORTTMluciferase vector載體，并將其與pRL-TK質粒共轉染進入A549細胞，之后分別將等量的pre-miR-202和miR-NC再轉染進入A549細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。結果miR-202在A549細胞中的相對表達量顯著低于在BEAS-2B細胞中的表達量(P<0.01)；miR-202 minic組在12、24、48和72 h的細胞抑制率顯著高于對照組和miR-NC組(P<0.01)；miR-NC組在72 h時細胞抑制率顯著高于對照組(P<0.01)。此外， miR-202 minic組細胞凋亡率顯著高于miR-NC和對照組(P<0.01)，并且miR-NC組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。熒光素酶報告基因結果說明GLI-2是miR-202的靶基因。miR-202minc轉染A549細胞后可顯著降低GLI-2蛋白的表達，而miR-NC組與對照組相比較，GLI-2蛋白表達無顯著差異。結論miR-202通過下游靶基因GLI-2調控肺癌A549細胞的增殖和凋亡，其可作為治療肺癌的潛在靶點。

【關鍵詞】miR-202；支氣管肺癌；GLI-2；細胞增殖；細胞凋亡

肺癌嚴重威脅著人類的生命健康，在過去的幾十年，隨著人口老齡化、污染以及各種致癌物質的被動攝入增加，導致肺癌的發(fā)生率逐年升高[1-3]。盡管近年來診療手段的不斷發(fā)展，但是肺癌患者5年生存率仍低于15%[4-5]。因此，亟待探索新的治療策略和方法。

microRNAs (miRNAs)是普遍存在于細胞內、僅有18-25bp的非編碼RNA。miRNA主要功能是通過與其mRNA的3′端非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)結合，抑制靶mRNA的翻譯或直接降解mRNA，從而抑制靶蛋白的表達及其功能[6]。近年來對miRNA的研究表明，其在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。既往研究表明，上調miR-202可抑制LRP6蛋白的表達，進而抑制肝細胞癌的增殖[8]。在多發(fā)性骨髓瘤中，miR-202發(fā)揮著負性調節(jié)細胞生存、增殖和粘附的功能[9]，但是miR-202在肺癌中發(fā)揮何種作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-202在肺癌A549細胞中的作用及其可能的機制，為肺癌的治療提供新的靶點和策略。

材料與方法

一、實驗材料

DMEM培養(yǎng)基、 F12K培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；TRIzol、lipofectamine 2000購自Invirogen公司；miR-NC、miR-202 minic和pre-miR-202 minic購自廣州銳博生物公司；逆轉錄試劑盒、M-PER細胞裂解液、T4連接酶、HindⅢ和Spe I限制性內切酶購自Thermo Fisher scientific 公司；實時定量試劑盒購自Roche公司；凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術公司；GLI-2單克隆抗體均購自abcam公司，GAPDH購自北京天德悅公司；CKK-8試劑盒購自日本同仁公司；pMIR-REPORTTMluciferase和pRL-TK 質粒載體購自ABI生物技術公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自peromega公司。

二、實驗方法

1. 非小細胞肺癌細胞A549和支氣管上皮細胞BEAS-2B的培養(yǎng): A549細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中，BEAS-2B細胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。兩種細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2. miR-202表達的檢測: 按照TRIzol提取總RNA試劑盒說明書提取細胞的總RNA。miR-202逆轉錄引物為5′- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG CAATTCAGTTGAGCAAAGAAG-3′, 內參U6的逆轉錄引物為5′- CAAAATATGGAACGCTTC-3′, 逆轉錄條件為42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min。 cDNA采用BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR檢測miR-202的表達，以U6作為內參(表1)。每個待測基因設4個復孔。數(shù)據(jù)通過BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進行處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計算各組間的倍數(shù)關系。

表1　基因序列及擴增片段長度

3. miR-202 模擬物(minic)、miR-202前體(pre-miR-202)及miR-NC的轉染: 將miR-202 minic、pre-miR-202及miR-NC干粉用RNase-free H2O 配制成20 μmol/L的儲存液后，分裝、凍存?zhèn)溆谩iR-202 minic轉染細胞的簡要操作如下：①將A549細胞球用胰酶消化，并將細胞球體吹散成為單個細胞，離心洗滌后用SFM重懸，在每孔含有440 μl SFM培養(yǎng)基的24孔板中接種約2×105個/孔的細胞；②將5 μl濃度為20 μmol/L 的miR-202 minic加入到50 μl opti-MEM中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；③在上述混合液中加入5 μl轉染試劑lipofectamine 2000，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min；④將60 μl轉染試劑-抑制物混合試劑加入含有細胞的孔板中，輕輕混勻，miR-202 minic的轉染終濃度為100 nmol/L；⑤將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行PCR和Western blot等檢測。pre-miR-202及miR-NC的轉染同miR-202 minic的轉染步驟。

4. 熒光素酶報告基因檢測: 首先，利用點突變技術擴增出含有HindⅢ和Spe Ⅰ酶切位點的GLI-2 突變位點的3′UTR。然后分別將野生型和突變型GLI-2 3′UTR 插入pMIR-REPORTTMluciferase vector載體；其次分別將含有野生型和突變型GLI-2 3′UTR的 pMIR- luciferase質粒載體與pRL-TK質粒共轉染進入A549細胞，然后分別將等量的pre-miR-202和miR-NC再轉染進入A549細胞；最后，轉染48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

5. 流式細胞術檢測細胞凋亡: 收集107個細胞后用含有2% FBS的PBS(buffer)重懸，300×g離心10 min后棄去上清，加入80 μl Buffer后，再加入 5 μl的 Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15 min，上機前加入 5 μl 的 PI 染色，室溫避光孵育 10 min，使用流式細胞儀檢測。

6. Western blot檢測GLI-2蛋白的表達: 收集細胞，加入350 μL M-PER蛋白裂解液，置于冰上15 min，然后4 ℃、以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15 min，取上清液。調整濃度后，沸水中將蛋白煮10 min使其變性。制備SDS-PAGE凝膠，每孔加樣40 μg進行電泳。300 mA濕轉120 min，將PVDF膜室溫封閉1 h后分別加入GLI-2(1︰1 000)及兔抗β-actin抗體(1︰10 000)的抗體稀釋液中4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，再放入辣根酶標記山羊抗兔的二抗(1︰50 000)中室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，用ECL化學發(fā)光法檢測GLI-2和β-actin蛋白的表達水平。所得蛋白條帶圖片，使用Quality one軟件對圖像進行分析，以β-actin的光密度值作為內參來校正各自目的蛋白的光密度值。

7. MTT檢測細胞增殖: 取對數(shù)生長期的A549細胞消化后制成細胞懸液，計數(shù)并將細胞濃度調整到5×103/孔，接種于96孔板上。培養(yǎng)48 h后換液，每孔加入10 μl(5 mg/ml)的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入100 μl Formanzan溶液，繼續(xù)孵育直至顯微鏡下觀察到Formanzan全部溶解。用酶標儀在570 nm處檢測各孔吸光度(OD值)，空白孔調零。

三、統(tǒng)計學方法

各實驗至少重復3次，使用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間進行t檢驗，多組之間進行單因素方差分析。

結　　果

一、miR-202在A549細胞和肺上皮細胞BEAS-2B細胞中的表達

本研究利用qPCR檢測了miR-202在A549細胞和肺上皮細胞BEAS-2B細胞中的表達。發(fā)現(xiàn)miR-202在A549細胞中的相對表達量僅為BEAS-2B細胞的40±4.5%，miR-202在A549細胞中的相對表達量顯著低于在BEAS-2B細胞中的表達量(P<0.01)，見圖1。

圖1qPCR檢測miR-202在A549細胞和肺上皮細胞BEAS-2B細胞中的表達；注：*與BEAS-2B細胞比較P<0.01

二、轉染miR-202 minic對 A549細胞增殖凋亡的影響

分別將miR-202 minic和miR-NC 轉染進入A549細胞48 h后，利用qPCR檢測A549細胞中的miR-202表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-202 minic和miR-NC組中miR-202的相對表達量分別是對照組的3.04±0.13和1.11±0.02倍，miR-202 minic和miR-NC組中miR-202的相對表達量顯著高于對照組(P<0.01)，并且miR-202 minic 組中miR-202的表達較miR-NC中的顯著升高(P<0.01) (見圖2A)。利用MTT檢測轉染miR-202 minic和miR-NC后72 h內，其對細胞活力的抑制情況(見圖2B)，發(fā)現(xiàn)miR-202 minic在12、24、48和72 h的細胞抑制率分別0.8± 0.05%、3.7±0.60%、24.5±3.40%、47.3±5.60%和59.8±4.90%。miR-NC組各時間點的細胞抑制率分別0.9±0.02%、2.5±0.30%、4.3±0.80%、5.6±0.78%和7.8±0.90%。對照組各時間點的細胞抑制率分別0%、1.3±0.02%、3.5±0.03%、4.1±0.70%和4.7±0.50%。miR-202 minic組在12、24、48和72 h的細胞抑制率顯著高于對照組和miR-NC組(P<0.01)。miR-NC組在72 h時細胞抑制率顯著高于對照組(P<0.01)。此外，使用流式細胞術檢測了轉染48 h后的miR-202 minic和miR-NC對細胞凋亡的影響(見圖2C)， 發(fā)現(xiàn)miR-202 minic組、 miR-NC組和對照組的細胞凋亡率分別為54.20±5.68%、12.51±4.39%和2.53±1.03%。miR-202 minic組細胞凋亡率顯著高于miR-NC和對照組(P<0.01)，并且miR-NC組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。上述研究說明上調miR-202的表達可顯著抑肺癌A549細胞的增殖、誘導其凋亡。

圖2上調miR-202對A549細胞增殖和凋亡的影響；注： A. qPCR檢測A549細胞轉染miR-202 minc和miR-NC后的miR-202的表達；B. MTT檢測A549細胞轉染miR-202 minc和miR-NC后，其對細胞增殖抑制的作用。*, 與對照組比較P<0.01；^, 與miR-NC組比較P<0.01；C. 流式細胞術檢測A549細胞轉染miR-202 minc和miR-NC后，其誘導細胞凋亡的作用

三、GLI-2是miR-202的下游直接靶點

通過miRNA預測軟件DIANA-MICROT、targetscan以及MIRDB進行分析，推測GLI-2為miR-202的靶基因。分別構建GLI-2 野生型和突變型3′UTR質粒載體(模式圖見圖3A)，與pRL-TK質粒、pre-miR-202或miR-NC一起轉染到A549細胞中后檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)野生型GLI-2 3′UTR質粒和pre-miR-202共轉染組，其熒光素酶活性顯著低于野生型GLI-2質粒和miR-NC共轉染組(P<0.01)。而突變型GLI-2 3′UTR質粒和pre-miR-202共轉染組與突變型GLI-2 3′UTR質粒和miR-NC共轉染組的熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，說明GLI-2是miR-202的直接靶點(見圖3B)。此外，我們還檢測了A549細胞轉染miR-202minc 和miR-NC后GLI-2蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-202minc轉染A549細胞后可顯著降低GLI-2蛋白的表達(P<0.05)，而miR-NC組與對照組相比較，GLI-2蛋白表達無顯著差異(P>0.05) (見圖3C)。進一步說明GLI-2是miR-202的直接靶點。

圖3GLI-2是miR-202的下游直接靶點；注：A. miR-202與GLI-2 3′UTR端結合以及構建突變型GLI-2 3′UTR端的模式圖；B.熒光素酶報告基因檢測miR-202與GLI-2 3′UTR端的結合情況；*, 與野生型GLI-2 3′UTR質粒和pre-miR-202共轉染組P<0.01；C. western blot檢測轉染miR-202與miR-NC 48 h后，A549細胞中GLI-2蛋白的表達情況

討　　論

本研究發(fā)現(xiàn)上皮來源的肺癌A549細胞中miR-202的表達顯著低于正常肺上皮BEAS-2B細胞。我們應用miR-202 minic 轉染A549細胞后，發(fā)現(xiàn)其能下調GLI-2的表達，能有效抑制A549的增殖并誘導其凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在A549細胞中GLI-2是miR-202的直接靶點。因此，推測miR-202通過調控GLI-2，進而可影響A549細胞的增殖和凋亡。

最近的研究表明，miRNA的紊亂在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]。miR-21在肺癌組織中顯著上調[11]，并且通過抑制抑癌基因APaf1、Fas1g、RhoB和PTEN，從而促進肺癌的進展[12]。miR-17/92a簇，包含miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、 miR-19b-1和 miR-92a等同樣也在肺癌中呈高表達。通過調控HIF-1a、PTEN、BCL2L11、CDKNA、TSP-1等基因，從而促進血管的生成、促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[13]。其他研究也同樣發(fā)現(xiàn)Lethal-7 (let-7)在肺癌組織中呈低表達，并且其表達水平與肺癌預后密切相關[14-15]。Let-7主要通過下調K-RAS、MYC和HMGA2等癌基因，進而發(fā)揮抑制肺癌發(fā)生、發(fā)展的作用[16]。近期對肺癌組織的miRNA芯片篩查中，發(fā)現(xiàn)miR-202在肺癌組織中較正常肺組織中表達顯著下調[17]。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)，肺癌A549細胞中miR-202的表達明顯低于正常肺上皮細胞的表達。我們通過miR-202 minic上調A549細胞中miR-202的表達，發(fā)現(xiàn)其能有效的抑制A549細胞的增殖。同樣，miR-202也可抑制肝癌細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖、促進其凋亡[8-9]。但其精確的作用機制尚不清楚。

本研究通過生物信息學分析對miR-202的下游靶點進行預測，并利用熒光素酶報告基因，在A549細胞中驗證了膠質瘤相關癌基因家族鋅指蛋白-2 (glioma-associated oncogene family zinc figure 2, GLI-2)是miR-202的靶基因。GLI-2是GLI家族成員之一，也被稱為HPE9、THP，是由1586個氨基酸組成的核蛋白，主要作為轉錄激活子發(fā)揮作用。進一步研究表明，GLI-2是hedgehog (Hh) 信號通路的重要效應分子，Hh信號通路可通過GLI-2，進而激活轉錄因子，上調各種靶蛋白從而發(fā)揮功能[18]。Im等發(fā)現(xiàn)，乳腺癌和肝癌組織中GLI-2陽性表達的患者總體生存率顯著低于肺癌組織中GLI-2陰性表達患者的生存率[19-20]。An等[21]研究發(fā)現(xiàn)上調GLI-2可促進胰腺癌細胞的增殖以及降低細胞對吉西他濱的敏感性。相反，采用siRNA敲除骨肉瘤細胞中GLI-2的表達，可顯著抑制細胞增殖活性，誘導其凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)上調miR-202可顯著降低GLI-2的表達，并且抑制細胞的增殖并誘導凋亡。因此，我們推測miR-202可能通過抑制GLI-2，進而抑制細胞的增殖、誘導其凋亡，但其具體機制仍不清楚。

本研究僅證實miR-202具有調控A549細胞短期增殖和凋亡的能力，尚未對調控長期增殖的能力以及體內miR-202是否發(fā)揮作用進行驗證。雖然觀察到上調miR-202可抑制GLI-2的表達，但GLI-2如何影響增殖和凋亡的具體機制尚不清楚。

綜上所述，miR-202可調控下游靶基因GLI-2，從而發(fā)揮調控A549細胞增殖、凋亡的作用，其可作為治療肺癌的潛在靶點。

參考文獻

1錢桂生. 為提高我國呼吸系統(tǒng)疾病的診治水平而努力[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2012, 5(1): 1-3.

2Han HS, Yun J, Lim SN, et al. Downregulation of cell-free miR-198 as a diagnostic biomarker for lung adenocarcinoma-associated malignant pleural effusion[J]. Int J Cancer, 2013, 133(3): 645-652.

3Cazzoli R, Buttitta F, Di Nicola M, et al. microRNAs derived from circulating exosomes as noninvasive biomarkers for screening and diagnosing lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2013, 8(9): 1156-1162.

4Ulivi P, Zoli W. miRNAs as non-invasive biomarkers for lung cancer diagnosis [J]. Molecules, 2014, 19(6): 8220-8237.

5Wang Y, Gu J, Roth JA, et al. Pathway-based serum microRNA profiling and survival in patients with advanced stage non-small cell lung cancer [J]. Cancer Res, 2013, 73(15): 4801-4809.

6Baek D, Villén J, Shin C, et al. The impact of microRNAs on protein output [J]. Nature, 2008, 455(7209): 64-71.

7Garzon R, Calin GA, Croce CM. MicroRNAs in Cancer [J]. Annu Rev Med, 2009, 60: 167-179.

8Zhang Y, Zheng D, Xiong Y, et al. miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally [J]. FEBS letters, 2014, 588(10): 1913-1920.

9Shen X, Guo Y, Yu J, et al. miRNA-202 in bone marrow stromal cells affects the growth and adhesion of multiple myeloma cells by regulating B cell-activating factor [J]. Clin Exp Med, 2015.

10Du L, Schageman JJ, Irnov, et al. MicroRNA expression distinguishes SCLC from NSCLC lung tumor cells and suggests a possible pathological relationship between SCLCs and NSCLCs [J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010, 29: 75.

11Gao W, Yu Y, Cao H, et al. Deregulated expression of miR-21, miR-143 and miR-181a in non small cell lung cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis [J]. Biomed Pharmacother, 2010, 64(6): 399-408.

12Hatley ME, Patrick DM, Garcia MR, et al. Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21 [J]. Cancer cell, 2010, 18(3): 282-293.

13Matsubara H, Takeuchi T, Nishikawa E, et al. Apoptosis induction by antisense oligonucleotides against miR-17-5p and miR-20a in lung cancers overexpressing miR-17-92 [J]. Oncogene, 2007, 26(41): 6099-6105.

14Yanaihara N, Caplen N, Bowman E, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis [J]. Cancer cell, 2006, 9(3): 189-198.

15Xia Y, Zhu Y, Zhou X, et al. Low expression of let-7 predicts poor prognosis in patients with multiple cancers: a meta-analysis [J]. Tumour Biol, 2014, 35(6): 5143-5148.

16Naidu S, Garofalo M. microRNAs: An Emerging Paradigm in Lung Cancer Chemoresistance [J]. Front Med (Lausanne), 2015, 2: 77.

17Wang R, Chen XF, Shu YQ. Prediction of non-small cell lung cancer metastasis-associated microRNAs using bioinformatics [J]. Am J Cancer Res, 2015, 5(1): 32-51.

18Fan P, Fan S, Wang H, et al. Genistein decreases the breast cancer stem-like cell population through Hedgehog pathway [J]. Stem Cell Res Ther, 2013, 4(6): 146.

19Im S, Choi HJ, Yoo C, et al. Hedgehog related protein expression in breast cancer: gli-2 is associated with poor overall survival [J]. Korean J Pathol, 2013, 47(2): 116-123.

20Zhang D, Cao L, Li Y, et al. Expression of glioma-associated oncogene 2 (Gli 2) is correlated with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma undergoing hepatectomy [J]. World J Surg Oncol, 2013, 11: 25.

21An Y, Cai B, Chen J, et al. MAP3K10 promotes the proliferation and decreases the sensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine by upregulating Gli-1 and Gli-2 [J]. Cancer Lett, 2013, 329(2): 228-235.

22Yang W, Liu X, Choy E, et al. Targeting hedgehog-GLI-2 pathway in osteosarcoma [J]. J Orthop Res, 2013, 31(3): 502-509.

(本文編輯：王亞南)

楊麗，王霞，楊永靜，等. miR-202調控GLI-2干預肺癌A549細胞的增殖和凋亡[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 252-257.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.004

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30801366)

通訊作者：胡明冬，Email: huhanshandd@aliyun.com

中圖法分類號：R563

文獻標識碼：A

Corresponding author：Hu Mingdong, Email: huhanshandd@aliyun.com

(收稿日期：2016-04-13)

miR-202 regulation proliferation and apoptosis of lung cancer A549 cells via target gene GLI-2

YangLi,LuoLi,LiChanggui,SunXiaorong,HuMingdong.Desect1mentofRespiratoryDiseases,XinQiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism and effect of miR-202 regulation the proliferation and apoptosis of A549 cells. MethodA549 cells and lung epithelial BEAS-2B cells were cultured, and then miR-202 level of A549 and BEAS-2B cells was analyzed by realtime-PCR. The sequence of miR-202 and miR-NC was synthesized. They were transfected into A549 cells, the rate of proliferation inhibition was detected by MTT at 12, 24, and 48 h, cellular apoptosis rate of A549 cells and the GLI-2 protein expression was measured by FACS and western blot at 48 h, respectively. The wild-type and mutation of GLI-2 3′UTR was inserted into the plasmid of pMIR-REPORTTMluciferase vector, which was cotransfected into A549 with pRL-TK plasmid. pre-miR-202 and miR-NC was transfected into these cells, which had been transfected pMIR-REPORTTMluciferase vector and pRL-TK plasmid. Firefly and Renilla reniformis luciferase activities were measured 48 h later. Result the expression of miR-202 was lower in A549 cells than in BEAS-2B cells (P<0.01). The cellular inhibition rate was higher in miR-202 minic group than in miR-NC and control group at 12, 24, 48, and 72 h (P<0.01), and the cellular inhibition rate was significant higher in miR-NC group than control group (P<0.01). Moreover, the apoptosis of A549 cells was higher in miR-202 minic group than in miR-NC and control group at 72 h (P<0.01). Luciferase assay showed GLI-2 was a direct target gene of miR-202. Up-regulation of miR-202 was significant decreased the expression of GLI-2 while miR-202 minic was transfected into A549 cells. GLI-2 protein expression was no significant difference between miR-NC group and control. ConclusionmiR-202 regulated the proliferation and apoptosis of A549 cells through directed mediated target gene GLI-2, and it would as a novel target for lung cancer treatment.

【Key words】miR-202；bronchus lung cancer；GLI-2；Proliferation；Apoptosis