丹參多酚酸鹽改善擴張性心肌病心肌功能的作用機制

王曦燁, 單曉彤, 王伊林, 李　丹, 趙　明, 許　良

( 1. 內蒙古民族大學化學化工學院, 通遼 028042;2. 天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室, 通遼 028042; 3. 內蒙古民族大學附屬醫院, 通遼 028042)

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丹參多酚酸鹽改善擴張性心肌病心肌功能的作用機制

王曦燁1,2, 單曉彤3, 王伊林3, 李丹1,2, 趙明3, 許良1,2

( 1. 內蒙古民族大學化學化工學院, 通遼 028042;2. 天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室, 通遼 028042; 3. 內蒙古民族大學附屬醫院, 通遼 028042)

摘要將代謝組學與分子生物學方法相結合, 研究了丹參多酚酸鹽治療擴張性心肌病的作用機制. 采用主成分分析(PCA)法, 分析了健康組、 模型組及丹參多酚酸鹽給藥組大鼠血清代謝輪廓, 采用正交校正的偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法尋找潛在的生物標記物, 共鑒定得到磷酯酰絲氨酸[16∶0/18∶1(9Z)]、 溶血磷脂(16∶0)、 溶血磷脂[20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)]、 溶血磷脂[22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、 膽固醇硫酸酯、 膽汁酸、 γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚9種潛在的生物標記物. 其中, γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚的含量在模型組中下降, 經丹參多酚酸鹽治療后含量上升. 通過Western bloting法和酶聯免疫吸附法證實丹參多酚酸鹽通過影響體內與γ-亞麻酸和9′-羧基-γ-生育酚相關的超氧化物岐化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)及其下游Bcl-2和Bax蛋白分子表達量, 從而減少氧化應激所致的心肌細胞凋亡數量, 達到治療阿霉素所致擴張型心肌病的目的.

關鍵詞擴張型心肌病; 丹參多酚酸鹽; 代謝組學; 質譜; 氧化應激

阿霉素(ADR)屬蒽環類抗癌藥物, 其獨特的嗜心肌作用可引起心腔擴大及室壁變薄等擴張型心肌病樣改變[1], 發病機制并不完全明確, 目前沒有特效藥物能阻止阿霉素所致擴張性心肌病的發生.

丹參是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根和根莖, 在《本草綱目》中早有記載, 且評價頗高. 丹參具有“祛瘀止痛, 補血生血, 逐血生新”等功效. 藥理學研究發現, 丹參具有改善血液循環、 降低心肌耗氧量及減少心律失常等藥理作用[2,3]. 丹參多酚酸鹽(Salvianolatemiltiorrhiza)是中藥丹參的有效提取物. 陳成等[4]研究發現, 丹參多酚酸鹽可通過影響心肌肌球蛋白重鏈, 從而提高心衰大鼠心臟功能. 方凌燕等[5]報道了丹參多酚酸鹽可上調心肌組織中micRNA表達水平, 促進心肌梗死大鼠的血管重生. 張殿福等[6]報道了丹參多酚酸鹽可通過抗炎和抗氧化等途徑治療心血管方面疾病. 迄今, 有關丹參多酚酸鹽的藥理作用研究多是基于分子生物學、 細胞生物學及藥代動力學等方面, 而丹參多酚酸鹽治療擴張性心肌病的代謝組學研究鮮見報道.

代謝組學是一門關于生物體內源性代謝物整體及其變化規律的科學, 當正常機體受到毒性物質、 代謝障礙或生理因素的影響時, 代謝物的種類和濃度會發生顯著變化. 目前, 代謝組學方法已被廣泛應用[7～9], 但通過代謝組學方法推斷得到的代謝通路缺少分子生物學方面的實驗驗證.

本文將代謝組學與分子生物學方法相結合, 對正常大鼠、 擴張性心肌病大鼠及應用丹參多酚酸鹽干預后大鼠的血清中內源性小分子進行分析檢測, 推斷代謝通路, 并利用Westernbloting法與酶聯免疫吸附實驗對代謝通路進行驗證, 進而闡述擴張性心肌病的發病機制及丹參多酚酸鹽的治療機制, 從而為丹參多酚酸鹽治療擴張性心肌病提供理論依據.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

甲醇和甲酸(色譜純, 美國ThermoFisher公司); 提取用乙醇(分析純, 北京化工廠); 去離子水由Milli-Q純水儀制備(美國Millipore公司); 阿霉素, 批號為 1206E4(深圳萬樂藥業有限公司); 注射用丹參多酚酸鹽, 批號為061121(上海第一生化制藥廠);Bax,Bal-2和GAPDH內參抗體(Wanleibio公司); 超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和ELISA試劑盒(深圳欣博勝生物有限公司).

AcquityUPLCSystem超高效液相色譜儀、WatersxevoG-2SQTOF質譜儀和AcquityBEH-C18色譜柱(50mm×2.1mm, 1.7μm)(美國Waters公司);GEVIVIDE9彩色超聲波診斷儀(美國GE公司);DYY-7C電泳儀、DYCZ-40D轉移槽、DYCZ-24DN雙垂直蛋白電泳儀和WD-9413B型凝膠成像系統(北京六一公司).

1.2實驗過程

1.2.1擴張性心肌病模型的建立健康Wister雄性大鼠24只, 每只體重200g, 常溫(20 ℃)條件下, 每日日照14h, 正常飲食, 適應7d環境后, 隨機分為正常組(C組)(n=8)、 模型組(M組)(n=8)和給藥治療組(T組)(n=8).M組腹腔注射ADR2mg/kg, 3次/周, 間隔2周, 再注射1周, 總共6次;T組腹腔注射ADR后, 用丹參多酚酸鹽以40mg/kg灌胃, 3次/周, 間隔2周, 再灌胃1周, 總共6次;C組腹腔注射0.9%(質量分數)NaCl(10mL/kg), 方法同ADR注射方法, 停藥后自由飲食4周[10]. 在丹參多酚酸鹽給藥組大鼠末次給藥24h后, 將3組大鼠全部麻醉處死, 取血, 以3000r/min轉速離心, 分別收集空白C組、M組和T的血清, 于-80 ℃儲存備用.

1.2.2血液樣品的收集和制備血液樣品檢測前, 于4℃融化樣品, 在100μL樣品中加入400μL乙腈, 渦旋振蕩30s, 在4 ℃下以12000r/min轉速離心10min, 上層清液用0.22μm濾膜過濾, 待測.

1.2.3大鼠心臟彩超檢測應用GEVIVIDE9彩超機對各組大鼠于第7周末進行多普勒心臟超聲檢測, 圖1為C組、M組和T組大鼠的心臟超聲圖. 由表1可見, 與C組比較,M組左室舒張末期內徑(LVIDd)、 左心室收縮末期內徑(LVSd)明顯增大, 左心室后壁(LVPWDd)明顯變薄, 射血分數(LVEF)減低(P<0.05), 符合擴張性心肌病改變, 說明造模成功; 而T組大鼠與M組大鼠相比較,LVIDd,LVSd,LVPWDd和LVEF值均有向正常大鼠改變的趨勢, 具有統計學意義(P<0.05), 說明丹參多酚酸鹽對擴張性心肌病有明顯的治療作用.

Fig.1　 Heart color doppler ultrasound of control group(A), model group(B) and treatment group(C)Table 1　Effect of salvianolate miltiorrhiza on ventricular structure and ejection fractionin rats with dilated cardiomyopathy

GroupLVIDd/mmLVSd/mmLVPWDd/mmLVEF(%)C4.73±0.41**1.74±0.1**2.1±0.33**85.5±3.23**M5.83±0.592.08±0.191.73±0.0770.4±5.69T5.26±0.33**1.99±0.18**1.91±0.09**76.2±3.19**

**P<0.01(vs.modelgroup).LVIDd:leftventricularinternaldiastolicdiameter;LVSd:leftventricularenddiastolicdiameter;LVPWDd:leftventriculardiastolicposteriorwalldiastolicdimension;LVEF:leftventricularejectionfraction.

1.2.4大鼠左室心肌氧化應激驗證實驗病理取材在第7周末, 將大鼠在麻醉狀態下于腹正中線剪開, 腹主動脈抽血處死, 在無菌狀態下將大鼠左肋剪開, 暴露心臟, 將心臟取出, 剪下一部分左室壁部分心肌標本, 根據細胞量加入9倍體積的磷酸鹽緩沖溶液, 吹散成細胞懸液, 用液氮反復凍融3次后在4 ℃下以12000r/min轉速離心10min, 上層清液為實驗所需蛋白組織勻漿, 于-20 ℃保存[11]. 采用ELISA法檢測各組大鼠SOD和MDA氧化應激指標, 另采用Westernbloting技術檢測各組大鼠心室肌Bcl和Bax蛋白.

1.2.5色譜及質譜分析條件色譜分析條件: 柱溫40 ℃, 二元線性梯度洗脫: 流動相A為含0.1%(體積分數)甲酸的水溶液,B為甲醇. 流動相梯度組成: 1～3min, 8%～85%B; 3～6min, 85%～100%B; 6～8min, 100%B; 8～9min, 100%～8%B; 9～11min, 8%B. 流速0.4mL/min, 樣品進樣量10μL.

質譜分析條件:ESI離子源, 采用正、 負離子模式, 掃描范圍m/z 100～1000. 正離子模式: 毛細管電壓3kV, 錐孔電壓40V, 離子源溫度100 ℃, 霧化溫度400 ℃, 殼氣流速800L/h; 負離子模式: 毛細管電壓2.5kV, 錐孔電壓40V, 離子源溫度80 ℃, 霧化溫度150 ℃, 殼氣流速600L/h.MS2碰撞能量為10～30eV. 質譜以亮氨酸腦啡肽作內標, 甲酸鈉校正質量軸.

1.2.6潛在的生物標記物篩選及解析用MasslynxV4.1軟件對超高效液相色譜-質譜聯用數據進行峰提取、 峰對齊及歸一化處理, 用EZinfo2.0軟件進行PCA和OPLS-DA分析, 根據VIP值(VIP>1.0)和P值(P<0.05) 篩選出潛在的生物標志物. 通過HMDB及METLIN等精確質量檢索數據庫, 篩選出最有可能的化合物, 最終通過數據庫標準圖譜確定標志物的化學結構.

Fig.2　Base peak intensity chromatograms(BPI) under the ESI+ mode(A, C, E) and ESI- mode(B, D, F)(A), (B) Control group; (C), (D) model group; (E), (F) treatment group.

2結果與討論

2.1代謝輪廓分析

利用UPLC-Q-TOFMS的正、 負離子模式對各組大鼠進行分析, 得到3 組基峰離子流色譜圖(圖2). 由圖2可見, 各組大鼠的血液代謝產物得到了良好分離, 正離子模式下相應信號大于負離子模式, 并且檢測到的物質多于負離子模式． 在正、 負離子模式下, 某些對應峰在3組色譜圖間存在明顯差異, 表明這些檢測結果可能具有統計學意義.

2.2代謝差異分析

PCA分析作為無監督的模式識別方法可以反映數據的原始狀態, 直觀地顯示不同樣品間的整體差異, 故首先對各組大鼠血液樣品進行PCA分析. 由圖3可見, 在正離子模式(R2X=0.9018, Q2=0.8352)和負離子模式(R2X=0.8609, Q2=0.8254)下, 3組血液樣本均可明顯區分, 表明擴張性心肌病造模成功, 而丹參多酚酸鹽對該疾病有明顯的治療效果.

Fig.3　PCA score plots obtained from the metabolic profiles of the control group, model group and treatment group under positive(A) and negative ion modes(B)

Fig.4　OPLS-DA score plots(A, C) and S-plots(B, D) obtained from the metabolic profiles of the control group and model group under positive(A, B) and negative ion modes(C, D)

為了找到引起擴張性心肌病的潛在生物標記物, 需要利用有監督的識別模式OPLS-DA分析. 有監督的模式識別方法可以擴大組間差異, 但需要利用外部模型驗證方法排列實驗來證明模型的有效性. 由圖4(A)和(C)可見, 在正離子模式(R2Y=0.9987, Q2=0.9854)和負離子模式(R2Y=0.9935, Q2=0.9577)下, 正常組與模型組大鼠血液樣本仍可被明顯區分. 為尋找潛在的生物標記物, 采用OPLS-DA對正常組和模型組樣本數據進行分析, 得到正、 負離子模式下的S-Plot圖[圖4(B)和(D)], 圖中“S”曲線的每一個點代表一個變量, 變量對分類的重要程度由VIP值的大小來衡量, 變量離遠點越遠,VIP值越大. 根據VIP值(VIP>1.0)和P值(P<0.05)篩選出潛在的生物標志物.

2.3主要生物標記物的分析

通過與數據庫標準譜圖進行比對, 共鑒定出9種潛在的生物標記物(見表2), 分別為磷酯酰絲氨酸[16∶0/18∶1(9Z)]、 溶血磷脂(16∶0)、 溶血磷脂[20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)]、 溶血磷脂[22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、 膽固醇硫酸酯、 膽汁酸、 γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚. 其中, 模型組相對于正常組, 膽固醇硫酸酯的含量升高, 其它成分含量下降; 大鼠經丹參多酚酸鹽治療后, γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚的含量相對于模型組明顯升高, 其它成分含量未發生明顯變化, 表明丹參多酚酸鹽可能通過影響γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚的代謝通路從而達到治療擴張性心肌病的目的. 將UPLC-QTOFMS數據導入HemI軟件[12], 對γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚進行了熱圖分析, 結果示于圖5.

Table 2　Potential biomarkers between control group and model group

Fig.5　Heatmap of metabolites between control(C) group, model(M) group and treatment(T) groupa. γ-linolenic acid; b. docosapentaenoic acid; c. 9′-carboxy-γ-chromanol.

9′-羥基-γ-生育酚是維生素E(VitaminE)酯水解為酚羥基后的代謝產物,Jiang等[13]通過實驗證實, 生育酚可影響維生素E的形式, 起到抗炎和抗癌的作用.Kamal等[14,15]發現, 維生素E和生育酚均具有強烈的抗氧化作用, 而生育酚還具有保護血管內皮、 減少氧化自由基對血管壁的破壞及擴張微小動脈的作用. 本研究發現,ADR所致擴張型心肌病大鼠心肌組織中的SOD和Bcl表達水平明顯下降, 而MDA和Bax表達明顯上升, 表明ADR可致大鼠心肌細胞發生氧化應激, 并使心肌細胞凋亡數量增加, 工作的心肌細胞數量減少, 從而導致心功能降低, 心臟擴大. 擴張型心肌病模型血清中9′-羥基-γ-生育酚的表達基本消失, 而經丹參多酚酸鹽干預后大鼠血清中9′-羥基-γ-生育酚的表達明顯升高, 說明丹參多酚酸鹽對ADR所致擴張性心肌病的氧化應激途徑有積極的治療作用.

γ-亞麻酸是人體必需的多不飽和脂肪酸, 它具有降脂、 殺菌、 抗炎、 抗血栓和抗氧化應激等多種生物學功能[16～18]. γ-亞麻酸由亞油酸分解產生, 擴張型心肌病患者心肌及血漿中亞油酸缺乏, 這可能是引起擴張型心肌病的發病因素[19], 而經STS干預治療后, γ-亞麻酸在血漿中的表達升高, 說明丹參酮多酚酸鹽對ADR所致擴張型心肌病大鼠脂肪酸代謝通路具有調節作用.

二十二碳五烯酸(EPA)屬于不飽和ω-3型不飽和脂肪酸, 是人體必需由外界攝入的脂肪酸, 在生物體內多個系統具有較強的生物功能, 具有調節血脂、 軟化血管、 促進生長發育和提高人體免疫功能等作用[20,21]. 生物體細胞量代謝的60%～90%來源于外周血中游離脂肪酸的氧化, 而當擴張型心肌病發生時, 心臟本身射血分數降低, 可能導致機體全身細胞處于乏氧狀態, 全身細胞迅速消耗掉外周血當中游離的不飽和脂肪酸為其供能, 繼而引發能量能量代謝障礙; 當應用STS干預治療擴張型心肌病大鼠后, 二十二碳五烯酸含量升高, 通過其抗氧化作用可以減少對心肌細胞的損害, 從而提高了心臟射血功能, 這證明了丹參酮多酚酸鹽對擴張型心肌病大鼠的脂肪酸代謝及能量代謝具有調節作用.

2.4代謝通路的驗證性分析

2.4.1第7周末大鼠左心室心肌組織SOD和MDA表達超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內天然的氧化酶, 可有效清除氧化自由基, 保護細胞受到氧化自由基攻擊; 而丙二醛(MDA)則是氧化應激發生指標, 二者若互為平衡, 則生物體處于健康狀態, 若MDA表達增多, 表明SOD的表達減少, 可推斷氧化應激的發生[22,23]. 由圖6可見, 與C組比較,M組大鼠心肌組織內SOD含量明顯下降(P<0.01), 丹參多酚酸鹽組大鼠較M組大鼠心肌組織內SOD含量明顯上升(P<0.01); 與C組比較,M組大鼠心肌組織內MDA含量明顯上升(P<0.01), 丹參多酚酸鹽組大鼠較M組大鼠心肌組織內MDA含量明顯下降(P<0.05), 說明應用丹參多酚酸鹽可有效減輕ADR對心肌細胞的氧化應激損傷.

Fig.6　Expression levels of MDA(A) and SOD(B) protein of rats left ventricular myocardial tissue in control group, model group and treatment group*P<0.05, **P<0.01(vs. model group).

Fig.7　Western blot analysis(A) and expression levels(B) of Bcl-2 and Bax protein of rats left ventricular myocardial tissue in control group, model group and treatment group**P<0.01(vs. model group).

2.4.2第7周末大鼠左心室心肌組織Bax和Bcl-2表達Westernbloting技術是檢測蛋白的重要半定量技術, 目標蛋白與內參蛋白的比值可以反映目標蛋白表達量的相對變化. 圖7(A)中,Bax和Bcl-2蛋白為目標蛋白, 而β-actin為內參蛋白,Bax/β-actin及Bcl-2/β-actin可以反映Bax和Bcl-2的相對表達量.Bcl-2是氧化應激“下游”的抗凋亡因子, 而Bax是氧化應激“下游”的凋亡因子,Bax可與Bcl-2結合形成二聚體, 從而減少抗凋亡分子與Bcl-2的同源二聚體化, 促進細胞凋亡[24,25]. 如圖7(B)所示, 與M組大鼠相比,C組大鼠左室心肌細胞中Bcl-2表達明顯減少(P<0.05), 而Bax表達增多(P<0.05), 表明M組大鼠左室心肌組織中異常凋亡正在發生;與M組相比,T組大鼠Bcl-2表達趨于正常(P<0.05), 而Bax表達下降(P<0.05), 說明丹參多酚酸鹽具有通過調節抗氧化分子表達水平抗心肌細胞凋亡的作用, 從而改善了擴張型心肌病大鼠的心臟功能.

3結論

將代謝組學與分子生物學方法相結合, 研究了丹參多酚酸鹽治療擴張性心肌病的作用機制. 通過代謝組學方法共鑒定了磷酯酰絲氨酸、 溶血磷脂、 溶血磷脂、 溶血磷脂、 膽固醇硫酸酯、 膽汁酸、 γ-亞麻酸、 二十二碳五烯酸和9′-羧基-γ-生育酚等9種內源性代謝產物. 實驗結果表明, 丹參多酚酸鹽通過影響脂肪酸代謝和抗氧化等通路發揮治療作用, 其中抗氧化通路是其減少心肌損傷的重要作用途徑. 本文闡述了丹參多酚酸治療ADR所致擴張型心肌病的作用機理, 為臨床治療擴張性心肌病提供理論依據.

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?SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos. 81560702, 81260682).

doi:10.7503/cjcu20150984

收稿日期:2015-12-26. 網絡出版日期: 2016-04-07.

基金項目:國家自然科學基金(批準號: 81560702, 81260682)資助.

中圖分類號O657

文獻標志碼A

MechanismofSalvia MiltiorrhizaontheImprovementofMyocardialFunctioninPatientswithDilatedCardiomyopathy?

WANGXiye1,2,SHANXiaotong3,WANGYilin3,LIDan1,2,ZHAOMing3*,XULiang1,2*

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028042, China;2. Key Laboratory of Natural Product Chemistry and Functional Molecular Synthetic of Autonomous Region, Tongliao 028042, China;3. Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028042, China)

AbstractMetabonomics combined with molecular biology were used to investigate the mechanisms of anti-dilated cardiomyopathy treated by depside salt from Salvia miltiorrhiza. The serum metabolic profiling of control group, model group and treatment group were analysed by principle component analysis(PCA). The potential biomarkers were selected with the help of orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA). As results, nine potential biomarkers including the PS[16∶0/18∶1(9Z)], LysoPC(16∶0), LysoPC[20∶4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)], LysoPC[22∶6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)], cholesterol sulfate, taurohyocholate, γ-linolenic acid, docosapentaenoic acid and 9′-carboxy-γ-chromanol were identified respectively. In addition, the relative content of γ-linolenic acid, docosapentaenoic acid and 9′-carboxy-γ-chromanol decreased in the model group, while increased in the treatment group. With the help of western bloting and enzyme-linked immunosorbent method, we confirmed that the depside salt from Salvia miltiorrhiza influenced the expression levels of superoxide disproportionation(SOD), malondialdehyde(MDA), Bcl-2 and Bax protein molecule(the proteins mentioned above were related with γ-linolenic acid and 9′-carboxyl-γ-tocopherol), and then reduced the amount of the apoptosis myocardial cell induced by oxidative stress, and treated the the dilated cardiomyopathy caused by adriamycin finally.

KeywordsDilated cardiomyopathy; Salvia miltiorrhiza; Metabonomics; Mass spectrometry; Oxidative stress

聯系人簡介: 許良, 男, 博士, 教授, 主要從事天然產物化學研究.E-mail:nmgxl66@163.com

趙明, 男, 博士, 主任醫師, 主要從事心血管疾病研究.E-mail:langzhe73@163.com