基于納米金催化的血清尿酸紙芯片的構(gòu)建及應(yīng)用

趙甜甜, 陳雨晴, 張　敏, 王月榮, 章弘揚(yáng), 胡　坪

(1. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2. 藥學(xué)院, 上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

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基于納米金催化的血清尿酸紙芯片的構(gòu)建及應(yīng)用

趙甜甜1, 陳雨晴1, 張敏2, 王月榮1, 章弘揚(yáng)1, 胡坪1

(1. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2. 藥學(xué)院, 上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

摘要建立了一種以紙芯片為平臺(tái), 利用納米金(AuNPs)的過氧化物模擬酶特性對(duì)血清中尿酸(UA)含量進(jìn)行快速檢測的方法. 在改裝的中性筆中灌注疏水性材料溶液, 直接在濾紙上繪制所需要的圖案, 經(jīng)干燥后形成紙芯片. 將納米金、 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和H2O2的混合液依次滴加于紙芯片檢測區(qū)域, 無色的TMB被氧化成藍(lán)色, 然后將待測樣品滴加于藍(lán)色區(qū)域, 氧化態(tài)TMB被還原為無色, 根據(jù)手機(jī)相機(jī)記錄的檢測區(qū)域灰度值計(jì)算試樣中尿酸的濃度. 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了納米金在紙芯片上的用量、 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等參數(shù), 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下, 檢測尿酸的線性范圍為10.6～125 mg/L, 檢出限為4.64 mg/L, 加樣回收率為94.8%～108.5%. 該方法選擇性良好, 可用于測定血清樣品中尿酸的含量.

關(guān)鍵詞紙芯片; 納米金; 尿酸

紙芯片是微流控芯片的一種, 由Whitesides等[1]于2007年首先提出, 因其成本低廉、 操作簡單、 無需復(fù)雜的外圍設(shè)備, 且其基底與其它化學(xué)或生物檢測物具有很好的兼容性, 在臨床診斷[2,3]、 環(huán)境檢測[4～6]和食品質(zhì)量控制[7,8]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用. 目前, 紙芯片的設(shè)計(jì)方法主要包括噴墨打印法[9]、 光刻法[10]、 蠟印法[11]、 絲網(wǎng)印刷法[12]、 柔版印刷法[13]、 激光切割法[14]和刻蝕法[15,16]等, 這些方法存在墨盒易損壞、 芯片制作時(shí)間長、 設(shè)備昂貴及需要專業(yè)人員操作等局限性.Whitesides等[17]和Zhang等[18]分別采用繪圖儀和馬克筆繪制紙芯片, 但是繪圖儀的筆尖部位極易堵塞, 而用馬克筆制作的紙芯片疏水效果不太理想. 尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物, 它是一種重要的生物標(biāo)志物, 其在體內(nèi)的含量高低與痛風(fēng)、 高尿酸血癥、 腎病和高血壓等多種疾病具有密切關(guān)系. 目前檢測尿酸多采用色譜法[19]、 電化學(xué)方法[20]以及酶法[21,22]等. 色譜法需要昂貴的儀器, 電化學(xué)方法操作較復(fù)雜, 而傳統(tǒng)酶法主要用到2種酶(尿酸氧化酶和過氧化物酶)和色源物質(zhì), 酶的價(jià)格昂貴且儲(chǔ)存不方便, 并且酶的活性受外界條件影響較大(如溫度,pH值, 尤其是有機(jī)溶劑), 這都限制了這些方法的應(yīng)用.

本文在改裝的普通中性筆中灌注疏水性材料溶液, 然后直接在濾紙上繪制紙芯片, 以此紙芯片為檢測平臺(tái), 基于在納米金的催化下[23,24], 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)易被H2O2氧化成藍(lán)色物質(zhì), 而尿酸能將該氧化物再還原為無色TMB的原理, 建立了血清中尿酸的微流控紙芯片檢測方法. 經(jīng)條件優(yōu)化及實(shí)際樣品測定表明, 該方法簡單、 快速且準(zhǔn)確, 對(duì)于醫(yī)療資源缺乏地區(qū)的相關(guān)疾病診斷具有適用性.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、 抗壞血酸、H2O2、 甲醇、 四甲基聯(lián)苯胺、 正庚烷、 黃嘌呤、 次黃嘌呤、 肌酸酐、 肌苷、 葡萄糖和尿酸等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 烷基烯酮二聚體(AKD, 山東旺升新材料科技有限公司); 真空硅脂(江陰市家寶石化有限公司); 人體血清樣品(九江第一人民醫(yī)院); 超純水(電阻率18MΩ·cm). 所有用試劑均為使用前配制.

渦旋混合器(美國Scilogex公司); 離心機(jī)(杭州米歐儀器有限公司); 華為榮耀3C手機(jī)(手機(jī)相機(jī)像素為800萬, 深圳華為公司); 1號(hào)定性濾紙(英國Whatman公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1中性筆的改裝與紙芯片的制作取1支普通的書寫用中性筆, 用注射器吸除筆芯中的墨水, 將筆芯截?cái)? 只保留筆尖以上約1～2cm部分, 以方便灌注疏水性溶液. 取0.15g真空硅脂和0.5g烷基烯酮二聚體加入到12.5mL正庚烷中, 充分溶解, 將此混合液作為疏水劑. 用注射器將0.05mL疏水劑注入改裝筆中, 以直徑為8mm的孔板為模具, 在Whatman#1濾紙上繪出圓形圖案, 于100 ℃烘干3min.

1.2.2納米金的合成參照文獻(xiàn)[23]方法合成帶有正電荷的納米金(AuNPs). 將50μL(0.1mol/L)氯金酸和50μL(24g/L)抗壞血酸溶液加入到10mL超純水中, 于40 ℃下攪拌2min. 溶液顏色由淺黃色快速變?yōu)榱良t色, 即得帶正電荷的AuNPs.

1.2.3尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取0.02g尿酸標(biāo)準(zhǔn)品, 溶解在新配制的10mLNaOH(0.1mol/L)溶液中, 得到2g/L的尿酸儲(chǔ)備液. 使用時(shí), 分別用超純水將其稀釋成0, 25, 50, 75, 100和125mg/L的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.2.4尿酸的檢測尿酸的檢測原理: 當(dāng)無色的TMB和H2O2混合溶液遇到(+)AuNPs時(shí), 由于(+)AuNPs具有過氧化物模擬酶特性,TMB在其催化作用下很快被H2O2氧化為藍(lán)綠色, 加入尿酸后, 被氧化的TMB被尿酸還原為無色, 顏色變化程度與尿酸含量成正比.

尿酸的檢測方法: 取濃度為0.02mol/L的TMB甲醇溶液和8.82mol/L的H2O2水溶液按體積比5∶1混合, 作為顯色液. 取2μL(+)AuNPs溶液滴在紙芯片檢測區(qū)域, 再滴加2μL顯色液, 檢測區(qū)域變?yōu)樗{(lán)色. 取不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液, 依次滴加在紙芯片各檢測區(qū)域, 藍(lán)色快速變淺, 并在1.5min時(shí)趨于穩(wěn)定. 用手機(jī)對(duì)紙芯片檢測區(qū)域拍照, 照片用ImageJ軟件處理, 得到灰度值(藍(lán)色越深, 灰度值越小). 以尿酸溶液濃度為橫坐標(biāo), 以灰度值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.5血清樣品的前處理參照文獻(xiàn)[25,26]方法, 取0.1mL血清, 加入30μL10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸溶液, 渦旋混合1min, 以4000r/min轉(zhuǎn)速離心5min, 取上層清液, 然后加入2μL6mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值, 用0.22μm濾膜過濾, 濾液待用.

1.2.6血清中尿酸的HPLC測定采用HPLC法對(duì)血清中的尿酸值進(jìn)行比對(duì)分析, 色譜條件如下:ACE5AQ水性柱(250mm×4.6mm, 5μm), 檢測波長254nm, 柱溫25 ℃, 梯度洗脫, 流動(dòng)相由pH=3的醋酸溶液(溶劑A)和乙腈(溶劑B)組成, 梯度程序?yàn)槿軇〢保持20min, 然后在10min內(nèi)增加溶劑B體積分?jǐn)?shù)到40%并保持5min, 流速1mL/min.

2結(jié)果與討論

2.1水筆型號(hào)的選擇

常用的書寫中性筆筆尖寬度多為0.3, 0.4, 0.5和0.7mm, 實(shí)驗(yàn)選用同一品牌(Pilot)不同型號(hào)的中性筆, 經(jīng)改裝灌注疏水劑后用于制作檢測區(qū)域直徑為8mm的紙芯片, 然后負(fù)載5μL的藍(lán)色染料. 如圖1(A)所示, 對(duì)于用筆尖寬度為0.3mm的中性筆制作的紙芯片, 染料溢出疏水邊界, 疏水效果較差, 這是因?yàn)樘?xì)的筆尖導(dǎo)致在畫紙芯片的過程中, 疏水劑流到紙上的體積太少, 疏水劑不能完全滲透整張紙, 因此0.3mm的中性筆不能滿足實(shí)驗(yàn)要求. 而用筆尖寬度為0.4mm的中性筆制作的紙芯片[圖1(B)], 能將染料完全限制在疏水邊界內(nèi), 并且在紙芯片的反面, 染料也完全沒有溢出, 說明其疏水效果較好. 考慮到疏水劑在紙上的擴(kuò)散性, 過大的筆尖寬度會(huì)導(dǎo)致流到紙上的疏水劑體積過大, 使疏水界限寬度過寬, 從而降低所制作的紙芯片的分辨率, 故實(shí)驗(yàn)選擇筆尖寬度為0.4mm中性筆作為實(shí)驗(yàn)用筆.

Fig.1　Front views(A, C) and back views(B, D) of two paper-based microfluidic chips fabricated by the modified pen with a nib width of 0.3 mm(A, B) and 0.4 mm(C, D)

2.2疏水劑的選擇

疏水劑在紙上的擴(kuò)散率對(duì)紙芯片的分辨率影響較大, 而擴(kuò)散率與溶液的黏度密切相關(guān). 以正庚烷作為溶劑配制AKD溶液, 注入改裝筆后在濾紙上繪制寬度分別為3mm和2mm的通道. 從通道的一端滴加藍(lán)色染料, 由于疏水界限的限制, 染料會(huì)往另一端流動(dòng), 結(jié)果如圖2(A)所示. 可見, 通道疏水界限的寬度不均勻, 染料在通道內(nèi)的流動(dòng)性差, 且無法實(shí)現(xiàn)1mm通道的構(gòu)建, 因此采用正庚烷等黏度較小的溶劑溶解疏水劑所制作的紙芯片分辨率較差, 難以滿足實(shí)驗(yàn)要求. 為此, 在正庚烷中加入適量真空硅脂以增加溶液黏度, 繪制的通道由圖2(B)所示. 可見, 通道的疏水界限的寬度較窄且均勻, 當(dāng)通道寬度為1mm時(shí), 染料的流動(dòng)性仍然較好. 這是由于真空硅脂的加入有效降低了疏水劑在紙上的擴(kuò)散速度, 提高了所制作紙芯片的分辨率.

Fig.2　Influence of without(A) and with(B) the addition of vacuum silicone on the resolution of paper-based microfluidic chips

Fig.3　Effects of (+)AuNPs volume on the TMB oxidation(A) and detection of UA(n=3)(B)

2.3(+)AuNPs的加入量對(duì)尿酸檢測的影響

考察了(+)AuNPs加入量對(duì)尿酸檢測的影響. 將不同體積的(+)AuNPs溶液和2μL顯色液滴加在紙芯片檢測區(qū)域, 結(jié)果如圖3(A)所示. 未滴加(+)AuNPs時(shí), 檢測區(qū)也會(huì)發(fā)生由無色到藍(lán)色的變化, 但顏色達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間較長, 且最終顏色較淺(灰度值較大). 而隨著(+)AuNPs體積的增大, 顏色達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間逐漸縮短, 且最終顏色逐漸變深并趨于穩(wěn)定. 分別將2μL30mg/L的尿酸溶液加入到紙芯片檢測區(qū)域中, 結(jié)果如圖3(B)所示. 其中, 0μL(+)AuNPs檢測區(qū)域的藍(lán)色區(qū)域減少值最小, 即灰度值增幅最小, 而隨著(+)AuNPs體積的增加, 檢測區(qū)域的藍(lán)色區(qū)域明顯減小, 灰度值增幅增大. 這說明(+)AuNPs的加入有效促進(jìn)了顯色液顏色的轉(zhuǎn)化, 使尿酸的檢測更靈敏. 當(dāng)(+)AuNPs的體積增大到2μL后, 灰度值增幅基本不再變化, 因此確定實(shí)驗(yàn)中所用(+)AuNPs體積為2μL.

2.4反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化將2μL(+)AuNPs和2μL顯色液滴加在紙芯片上后, 每隔30s拍照, 繪制檢測區(qū)域灰度值與時(shí)間的關(guān)系曲線. 由圖4可見, 檢測區(qū)域灰度值隨著氧化反應(yīng)時(shí)間增長逐漸減小, 并在2min后顏色達(dá)到穩(wěn)定的藍(lán)色, 此時(shí)即可滴加尿酸試樣. 滴加3種不同濃度的尿酸溶液后發(fā)現(xiàn), 尿酸溶液的濃度對(duì)還原反應(yīng)的時(shí)間影響不大, 紙芯片檢測區(qū)域的灰度值均在1.5min后保持穩(wěn)定, 由此確定拍照時(shí)間為滴加尿酸試樣1.5min后.

Fig.4　Imaging time for UA detection(n=3)a. TMB substrate; b. UA(25 mg/L); c. UA(50 mg/L); d. UA(75 mg/L).

Fig.5　Effect of temperature on the detection of UA(n=3)

2.4.2反應(yīng)溫度的優(yōu)化在紙芯片上滴加2μL(+)AuNPs和2μL顯色液, 分別在10, 20, 30, 40和50 ℃下反應(yīng)2min, 然后滴加50mg/L的尿酸溶液, 分別在上述溫度下反應(yīng)1.5min, 結(jié)果如圖5所示. 在10～40 ℃時(shí), 反應(yīng)后紙芯片顏色基本一致, 而在50 ℃時(shí), 紙芯片灰度值明顯降低. 這可能由于較高的溫度使紙芯片纖維結(jié)構(gòu)過于干燥, 導(dǎo)致水相還原反應(yīng)進(jìn)行不徹底. 因此, 本方法適合在室溫下進(jìn)行, 無需加熱.

2.5干擾實(shí)驗(yàn)

Fig.6　Effects of different substances existing in serum on the UA detection a. Blank; b.1.0 mg/L of inosine; c. 10 mg/L of creatinine; d. 7.0 mg/L of hypoxathine; e. 0.4 mg/L of xanthine; f. 1000 mg/L of glucose; g. 200 mg/L of vitamin C; h—l. 10 mg/L of NO2-, Ca2+, Na+, Cl- and Fe3+; m. 50 mg/L of UA; n. the mixture of all above(n=3).

為了將本方法應(yīng)用于實(shí)際血清樣品的檢測, 考察了血清中與尿酸結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì), 如肌苷(Inosine)、 肌酸酐(Creatinine)、 次黃嘌呤(Hypoxanthine)、 黃嘌呤(Xanthine)、 葡萄糖(Glucose)和抗壞血酸(VitaminC)等, 以及各種離子對(duì)檢測的影響. 所選干擾物的濃度均高于人體正常值[19], 其結(jié)果如圖6所示. 可見, 在一定濃度下, 各種干擾物質(zhì)不會(huì)與顯色液發(fā)生明顯還原反應(yīng), 且尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及其與各種干擾物的混合溶液的檢測結(jié)果基本相同, 表明血清中雜質(zhì)對(duì)本方法的干擾較小.

2.6方法的回收率

采用加標(biāo)回收率考察了血清中尿酸測定的準(zhǔn)確度. 取實(shí)際血清樣本(經(jīng)HPLC測得尿酸濃度為39.6mg/L), 按3個(gè)不同的水平添加尿酸, 以上文中樣品預(yù)處理及檢測方法對(duì)加標(biāo)樣本進(jìn)行測定, 并計(jì)算加標(biāo)回收率, 結(jié)果列于表1. 可見, 方法回收率為94.8%～108.5%, 3次平行測定的RSD均小于10%, 表明該方法準(zhǔn)確可靠, 可用于實(shí)際血清樣品的檢測.

Table 1　Recovery of UA in serum samples spiked with different concentration of UA standard solution(n=3)

2.7實(shí)際血清樣品中尿酸的測定

Fig.7　Results of colorimetric assay of UA on paper-based microfluidic chips(A) and the calibration curve(B) #3 and #5 are samples number in Table 2.

采用建立的紙芯片檢測方法對(duì)8個(gè)實(shí)際血清樣品中尿酸的含量進(jìn)行了測定, 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示, 測定結(jié)果列于表2. 由圖7(A)可見, 檢測區(qū)域的藍(lán)色面積隨著尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的增大而減小, 當(dāng)尿酸濃度在10.6～125mg/L范圍內(nèi)時(shí), 檢測區(qū)域的灰度值與尿酸濃度呈良好的線性關(guān)系(y=0.7135x+129.5, R2=0.9823), 方法的檢出限為4.64mg/L(3σ/slope), 低于文獻(xiàn)[21,22]報(bào)道的酶法檢出限. 由表2可見, (+)AuNPs結(jié)合顯色液在紙芯片上的檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果基本一致, 進(jìn)一步表明該方法可用于血清樣品的檢測.

Table 2　Results of determination of UA by paper-based

3結(jié)論

利用改裝中性筆灌注疏水劑的方法制作紙芯片, 并利用(+)AuNPs結(jié)合顯色的方法檢測人體血清中的尿酸. 與其它檢測尿酸的方法相比, 紙芯片的制作方法簡單, 疏水效果和分辨率都能滿足實(shí)驗(yàn)要求; 在紙芯片上利用(+)AuNPs過氧化物模擬酶的特性催化TMB顯色的方法檢測尿酸, 檢出限低于酶法1個(gè)數(shù)量級(jí), 結(jié)果準(zhǔn)確; 且該方法不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備, 可實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)測定.

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(Ed.:N,K)

?SupportedbythetheNationalScienceandTechnologyMajorProjectforSignificantNewDrugsDevelopment,China(No.2013ZX09507005),theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81573397)andtheFundamentalResearchFundsfortheCentralUniversities,China.

doi:10.7503/cjcu20160045

收稿日期:2016-01-18. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-04-15.

基金項(xiàng)目:國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題(批準(zhǔn)號(hào): 2013ZX09507005)、 國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 81573397)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)探索項(xiàng)目資助.

中圖分類號(hào)O657

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

FabricationofPaper-basedMicrofluidicChipsandtheApplicationontheDeterminationofUricAcidinSerumBasedon

GoldNanoparticle-assistedCatalysis?

ZHAOTiantian1,CHENYuqing1,ZHANGMin2*,WANGYuerong1,ZHANGHongyang1,HUPing1*

(1. Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering,2. Shanghai Key Laboratory of New Drug Design, School of Pharmacy,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

AbstractA simple and fast method for the determiantion of uric acid(UA) in serum was developed using paper-based microfluidic chips and gold nanoparticles(AuNPs) as peroxidase mimic. The paper-based microfluidic chips were fabricated by directly drawing on filter paper with a modified gel pen filled with hydrophobic solution and then dried. When the AuNPs and the mixed solution of TMB and H2O2 were droped on the detection zone of paper-based microfluidic chips, the colorless TMB was oxidated to blue substance. Then the sample was added onto the blue zone, the blue-oxidated TMB was reducted to colorless. Finally the picture of detection zone could be captured by a mobile phone camera and the concentration of UA could be caclulated according to the gray value of the detection zone. Parameters influencing the UA determination were investigated, including volume of AuNPs, reaction time and temperature. Under the optimized conditions, the detection limit of UA could be reached to 4.64 mg/L, the linear range was from 10.6 mg/L to 125 mg/L and the recovery was from 94.8% to 108.5%. The method could be applied to determining uric acid in serum.

KeywordsPaper-based microfluidic chip; Gold nanoparticles; Uric acid

聯(lián)系人簡介: 胡坪, 女, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物分析方面的研究.E-mail:huping@ecust.edu.cn

張敏, 男, 博士, 副教授, 主要從事藥物分析方面的研究.E-mail:zhangm@ecust.edu.cn