蛇床子香豆素類成分的含量測定及指紋圖譜研究*

宋麗嬌，李　晉，姜　艷，陳　瑩，馬　琳，金　華，常艷旭

（天津市現代中藥重點實驗室，天津中醫藥大學，天津　300193）

·中藥研究·

蛇床子香豆素類成分的含量測定及指紋圖譜研究*

宋麗嬌，李晉，姜艷，陳瑩，馬琳，金華，常艷旭

（天津市現代中藥重點實驗室，天津中醫藥大學，天津300193）

［目的］采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定不同批次蛇床子中6種香豆素類成分的含量，并建立指紋圖譜分析方法評價其質量。［方法］采用高效液相色譜法測定蛇床子中花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素的含量，并對17批蛇床子藥材進行指紋圖譜相似度分析。色譜條件為Hedra ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速0.5 mL/min，檢測波長為320 nm。［結果］測定了不同批次蛇床子中6種化學組分的含量，建立蛇床子HPLC指紋圖譜，17批次藥材與對照指紋圖譜相似度均在0.980以上。［結論］建立的蛇床子中6種香豆素成分同時測定的HPLC方法及指紋圖譜可用于蛇床子的質量控制。

高效液相色譜法；蛇床子；指紋圖譜；香豆素類化合物

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實。蛇床子性溫、味苦，有小毒，具有燥濕祛風、殺蟲止癢、溫腎壯陽的功效，用于治療陰癢帶下、濕疹瘙癢、濕痹腰痛、腎虛陽痿和宮冷不孕［1］。在臨床上，外用治療各種皮膚病及滴蟲性陰道炎，手、足癬感染等疾病［2］。現代藥理研究發現蛇床子還具有一定防治骨質疏松及促進透皮吸收等作用［3］，而其主要化學成分蛇床子素具有抗炎、免疫調節、促進神經干細胞增殖和分化以及抗腫瘤［4-6］等作用。蛇床子主要含有蛇床子素、佛手柑內酯、花椒毒酚、花椒毒素、歐前胡素、異歐前胡素、異虎耳草素、哥倫比亞內酯等香豆素類化合物，倍半萜類揮發油，色酮類以及黃酮類化合物等成分［7-8］，由于香豆素類化合物結構相似，為蛇床子化學成分分離以及測定增加了一定難度［9］，故對其分析方法的優化不斷涌現［10-14］。本研究采用高效液相色譜法能夠同時測定蛇床子中6種香豆素類成分的含量，比較了不同批次樣品含量差異，并建立蛇床子藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，計算各批藥材相似度進行綜合質量評價。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括四元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，可變波長檢測器（VWD）；十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO）；BP121S萬分之一天平（德國賽托利斯公司）；SB-1000YDTD超聲清洗槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3K15離心機（德國Sigma公司）；中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2試劑與藥材

1.2.1試劑花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素對照品均購買于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇為色譜純（天津康科德試劑公司），甲酸（美國ACS恩科化學），其它試劑均為分析純，水為超純水（Millipore公司，Mill-QⅡ型）。

1.2.2藥材蛇床子藥材17批分別購自不同藥店。蛇床子藥材粉碎后過100目篩，備用。

2　實驗方法

2.1色譜條件色譜柱Hedra ODS-2柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；流速為0.5mL/min。梯度洗脫程序為：0～5min，5～35% A；5～13 min，35～60%A；13～30 min，60～65%A；30～38 min，65～75%A；38～45 min，75～90%A；45～50 min，90%A；50～58 min，90～95%A；58～59 min，95～5%A；柱溫為40℃；進樣量為10 μL；檢測波長為320 nm。其HPLC色譜圖如圖1所示。

*基金項目：國家自然科學基金青年項目（81503213）；天津市高等學校創新團隊培養計劃項目（TD12-5033）。

作者簡介：宋麗嬌（1991-），女，碩士在讀，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。

通訊作者：常艷旭，E-mail：tcmcyx@126.com。

圖1　蛇床子對照品（A）與樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of standards（A）and samples （B）of Cnidium monnieri（L.）Cuss

2.2對照品溶液的制備分別精密稱取花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素對照品，均用甲醇配制為1 mg/mL溶液，再分別吸取上述各標準品溶液一定量，并用甲醇稀釋得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，備用。2.3測定精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，進樣，測定，即得。

2.4正交實驗設計本實驗設計考察了不同甲醇提取濃度（50%、75%、100%）、不同料液比（0.1 g/5 mL、0.1 g/10 mL、0.1 g/20 mL）、不同提取時間（20 min、30 min、40 min）3個因素對這6個化合物提取總量的影響，根據正交設計軟件采用L9（34）正交表設計正交實驗［15］。

2.5供試品溶液的制備精密稱取蛇床子粉末0.05 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，超聲提取40 min，所得溶液14 000 r/min離心10 min，取上清，作為供試品溶液。

3　實驗結果

3.1方法學考察

3.1.1線性關系考察按照2.1項下的色譜條件依次進樣各濃度的混合標準品溶液，以對照品溶液的濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程，見表1。結果表明，花椒毒素、異虎耳草素和佛手柑內酯在0.400～100 μg/mL內呈良好的線性關系，而歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素分別在 0.800～200 μg/mL，1.600～400 μg/mL和0.250～50 μg/mL內呈良好的線性關系。

表1　蛇床子中6種有效成分的標準曲線、線性、定量限和檢測限Tab.1 The calibration curves，linearity ranges，LODs，LOQs of 6 active ingredients in Cnidium monnieri（L.）Cuss

3.1.2精密度實驗取同一混合對照品溶液，按上述2.1項下的色譜條件連續進樣6次，記錄花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素的峰面積，其相應峰面積的RSD分別為0.97%、1.02%、0.79%、0.81%、1.20%和0.53%，表明儀器精密度良好。

3.1.3重現性實驗取同一批次蛇床子藥材粉末6份，精密稱定，按上述2.1項下的色譜條件測定，計算花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素峰面積的RSD分別為3.39%、3.20%、3.31%、3.24%、3.41%和4.88%，表明本方法重現性良好。

3.1.4穩定性考察取同一混合對照品溶液，按上述2.1項下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12 和24 h進樣，計算6種化學成分峰面積的RSD分別為0.66%、0.83%、0.72%、1.08%、0.89%和0.70%，表明該樣品溶液在24 h內穩定性良好。

3.1.5加樣回收率實驗精密稱取已知含量的蛇床子粉末6份，分別加入一定量的花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素對照品溶液，按2.5項下方法提取并進行測定，計算這6種化合物的平均回收率，分別為101%、99.4%、99.4%、100%、97.7%和100%，結果見表2。

3.2樣品含量測定精密稱取17批蛇床子藥材粉末，按照供試品溶液的制備方法制備不同批次供試品溶液，根據回歸方程計算供試品溶液中6種香豆素類化合物含量，結果見表3。在測定蛇床子藥材的6種化學成分中，蛇床子素含量最高，其次為歐前胡素，花椒毒素、異虎耳草素與佛手柑內酯，而異歐前胡素含量最低，且在S10、S11、S13和S14批次中，其含量未達到定量限要求，故未列出其含量。

表2　蛇床子中6種有效成分的加樣回收率實驗結果Tab.2　The recoveries of 6 active ingredients in Cnidium monnieri（L.）Cuss

表3　不同批次樣品中6種化學成分的含量測定結果Tab.3 Contents of six active components in different batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss mg/g

3.3指紋圖譜的建立

3.3.1指紋圖譜的重現性、精密度和穩定性取同一批次蛇床子樣品6份，按上述方法提取，進樣并記錄色譜圖，計算各峰相對保留時間和峰面積，結果顯示各峰相對保留時間的RSD小于0.24%，相對峰面積的RSD小于2.92%，表明該方法重現性良好；取同一份樣品溶液連續進樣6次，計算其相對保留時間的RSD小于0.24%，相對峰面積的RSD小于2.61%，結果顯示精密度良好；取同一份樣品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12和24 h進樣并記錄色譜圖，計算各峰相對保留時間的RSD小于0.44%，相對峰面積的RSD小于2.89%，表明該樣品于24 h內穩定［16］。

3.3.2指紋圖譜的建立將上述17批蛇床子樣品HPLC色譜圖進行指紋圖譜分析，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）”軟件生成對照指紋圖譜，并進行數據處理［17］，其HPLC指紋圖譜見圖2。該指紋圖譜中有12個共有峰，其中可確認峰6所代表的化學成分為花椒毒素，峰8為異虎耳草素，峰9為佛手柑內酯，峰10為歐前胡素，峰11為蛇床子素。計算各批次蛇床子藥材指紋圖譜與生成的對照圖譜R的相似度，結果見表4。其相似度計算結果顯示，17批蛇床子藥材指紋圖譜相似度均大于0.980。

表4　相似度評價結果Tab.4　Results of similarity evaluation

4　討論

首先本實驗采用正交實驗對樣品提取條件進行優化，比較該6種化學成分的含量，結果顯示，0.1g蛇床子藥材于20 mL 100%甲醇超聲提取40 min的條件下其總量最高，故應用此條件作為供試品的最佳提取條件。HPLC測定不同批次蛇床子中6種香豆素類化合物的含量，采用甲醇-0.1%甲酸水進行梯度洗脫，分離效果較好，且峰形較佳。

目前傳統HPLC法同時測定香豆素類化合物的數目較少［18］，故發展了液-質聯用等方法對蛇床子進行定量［19］，但其成本較高，而本實驗采用HPLC法即可對17批蛇床子藥材中6種主要香豆素類化合物進行含量測定，結果顯示，17批蛇床子藥材中蛇床子素含量均在11.3～50.0 mg/g（1.13%～5.00%）范圍內，《中華人民共和國藥典》規定，本品按干燥品計算，含蛇床子素不得少于1.0%［1］，即各批藥材均符合中國藥典規定。本實驗以花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素和蛇床子素為指標，測定不同產地6種香豆素類化合物的含量，該結果表明廣西、安徽產蛇床子香豆素類化合物含量較高，即不同批次蛇床子其香豆素類化合物含量差異較大。中藥指紋圖譜能較全面地反映中藥中所含化學成分的組成及含量分布情況，進而對藥材質量進行整體描述和評價［20］。通過采用高效液相色譜法測定6種化學組分的含量，可得知不同批次藥材中6種化學成分的含量差異，故采用中藥指紋圖譜從而全面分析17批次藥材間差異。根據相似度計算結果可以得知，與對照指紋圖譜相比較，17批蛇床子藥材相似度均大于0.980，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求。根據HPLC測定結果，可確定17批次藥材有12個共有峰，其中包括本實驗已測定的化學成分，分別為花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內酯、歐前胡素與蛇床子素，故在采用HPLC指紋圖譜時可以與5種化學成分為指標來全面評價蛇床子藥材的質量差異，并為不同產地蛇床子樣品之間的鑒別提供科學依據。

圖2　17批蛇床子樣品HPLC指紋圖譜Fig.2　HPLC fingerprint chromatograms of 17 batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss

5　結論

建立了蛇床子中6種化合物同時進行分離與測定HPLC分析方法，該方法準確，簡便、易行。同時建立了蛇床子HPLC指紋圖譜，可對不同批次蛇床子的質量差異進行全面評價，可為蛇床子質量控制研究提供一定參考。

［1］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2015，315-316.

［2］陳艷，張國剛，余仲平.蛇床子的化學成分及藥理作用的研究進展［J］.沈陽藥科大學學報，2006，23（4）：256-260.

［3］黃彩虹，雷鵬，劉韶，等.高效液相色譜法同時測定蛇床子中蛇床子素和異茴芹素的含量［J］.中南藥學，2009，7（3）：171-174.

［4］Yao Y，Gao Z，Liang W，et al.Osthole promotes neuronal differentiation and inhibits apoptosis via Wnt/β-catenin signaling in an Alzheimer's disease model［J］.Toxicology and applied pharmacology，2015，289（3）：474-481.

［5］You L，An R，Wang X，et al.Discovery of novel osthole derivatives as potential anti-breast cancer treatment［J］.Bioorganic&medicinal chemistry letters，2010，20（24）：7426-7428.

［6］Pan Z，Fang Z，Lu W，et al.Osthole，a coumadin analog from Cnidium monnieri（L.）Cusson，stimulates corticosterone secretion by increasing steroidogenic enzyme expression in mouse Y1 adrenocortical tumor cells［J］.Journal of Ethnopharmacology，2015（175）：456-462.

［7］Song G，Zhou L，Sheng N，et al.Simultaneous quantification of 16 bioactive constituents in Common cnidium fruit by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015（107）：304-310.

［8］Zhao J，Zhou M，Liu Y，et al.Chromones and coumarins from the dried fructus of Cnidium monnieri［J］.Fitoterapia，2011，82（5）：767-771.

［9］李義敏，張巧艷，秦路平，等.HPLC法測定蛇床子中3種香豆素類成分的含量［J］.中藥材，2015，38（7）：1441-1443.

［10］Tian HZ，Jing XU，Guan YF.Vacuum-evaporation interface of comprehensive two-dimensional liquid chromatography and its application［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2008，36（6）：860-864.

［11］Chen D，Wang J，Jiang Y，et al.Separation and determination of coumarins in Fructus cnidii extracts by pressurized capillary electrochromatography using a packed column with a monolithic outlet frit［J］.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2009，50（5）：695-702.

［12］Zhou J，Sun XL，Wang SW.Micelle-mediated extraction and cloudpoint preconcentration of osthole and imperatorin from Cnidium monnieri with analysis by high performance liquid chromatography ［J］.Journal of Chromatography A，2008，1200（2）：93-99.

［13］Chen Y，Fan G，Zhang Q，et al.Fingerprint analysis of the fruits of Cnidium monnieri extract by high-performance liquid chromatography-diode array detection-electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2007，43（3）：926-936.

［14］陳丹霞.蛇床子藥材質量評價的現代色譜方法學研究［D］.上海：第二軍醫大學，2009：17-18.

［15］吳芳，范國榮.蛇床子總香豆素的測定及其提取條件的正交設計優選［J］.中藥新藥與臨床藥理，2002，13（2）：113-116.

［16］李磊，黎先春，王小如，等.丹參品質鑒定和評價的HPLC指紋條形碼技術［J］.中草藥，2003，34（7）：649-653.

［17］楊憲，楊水平，張雪.蛇床子藥材的高效液相色譜指紋圖譜［J］.藥學學報，2007，42（8）：877-881.

［18］仝立國，謝君，馮瑪莉.蛇床子中佛手柑內酯和異虎耳草素含量的高效液相色譜-二級管陣列檢測法同時測定［J］.時珍國醫國藥，2014，25（3）：536-538.

［19］李坤平，高崇凱，李衛民.UPLC/ESI-TOF-MS/MS分析蛇床子提取物中香豆素類化合物［J］.中成藥，2009，31（4）：584-587.

［20］孫玉剛，張玲，李晉，等.指紋圖譜法評價規范化種植青蒿藥材的質量［J］.中國醫院藥學雜志，2013，33（1）：29-31.

（本文編輯：高杉，于春泉）

Simultaneous determination of coumarins and fingerprint analysis in Cnidium monnieri（L.）Cuss.

SONG Li-jiao，LI Jin，JIANG Yan，CHEN Ying，MA Lin，JIN Hua，CHANG Yan-xu
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］A fingerprint analysis and simultaneous determination of six coumarins were established and validated to evaluate the quality of different batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss.［Methods］The contents of xanthotoxin，isopimpinelline，bergapten，imperatorin，osthole and isoimperatorin were determined by HPLC.The analysis was carried out on Hedra ODS-2 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol-0.1%formic acid water aqueous solution in gradient elution.The flow rate was 0.5 mL/min and the detection wave length was 320 nm.［Results］The contents of six components in various bathes of samples were determined and HPLC fingerprint was established.The similarities of 17 batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss.were more than 0.980.［Conclusion］The established method could be suitable to evaluate the quality control of Cnidium monnieri（L.）Cuss.

HPLC；Cnidium monnieri（L.）Cuss.；fingerprint；coumarins

R284.2

A

1672-1519（2016）06-0368-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.13

2016-01-18）