血管緊張素(1-7)對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的作用

何軍華，王　麗，吳慧璐，范運娟，王　巍，范　鑫，李　興

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血管緊張素(1-7)對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的作用

何軍華，王麗，吳慧璐，范運娟，王巍，范鑫，李興

山西醫科大學第二醫院(太原 030001)

摘要：目的探討血管緊張素(1-7)[Ang-(1-7)]對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠糖代謝及胰島β細胞凋亡的影響。方法健康雄性Wistar大鼠給予高脂高熱量飼料喂養，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，建立2型糖尿病模型大鼠共20只，隨機分為糖尿病對照組(D0組)和Ang-(1-7)干預組(D1組)，同時設正常對照組(NC組)。D1組給予Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)皮下注射，余兩組注射等體積生理鹽水。干預共持續8周，監測空腹血糖(FPG)，檢測血清中空腹胰島素(FINS)及Ang Ⅱ的含量，計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，免疫組化法檢測胰島細胞內iNOS及Caspase-3的蛋白表達，實時熒光定量PCR法檢測胰島iNOS、bax、bcl-2及Caspase-3的mRNA表達。結果與NC組相比，D0組大鼠FPG、AngⅡ及HOMA-IR明顯升高，FINS濃度降低，胰腺iNOS、Caspase-3的蛋白表達分別增加了77.1%、1.03倍，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表達水平分別增加3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2基因表達降低了74.8%(P<0.05)。與D0組相比，D1組FPG、Ang Ⅱ及HOMA-IR下降，FINS濃度升高，iNOS及Caspase-3蛋白表達分別降低了19.4%、37.2%，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表達水平分別降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2基因表達增加了81.2%(P<0.05)。結論Ang-(1-7)可通過降低胰島局部氧化應激,減少β細胞凋亡而改善STZ誘導的糖尿病大鼠胰島分泌功能及胰島素抵抗，發揮抗糖尿病作用。

關鍵詞：糖尿病；大鼠；血管緊張素(1-7)；胰島功能；細胞凋亡

近年來2型糖尿病與腎素-血管緊張素系統(Renin-angiotensin system，RAS)的關系備受關注，研究發現RAS阻斷劑可降低高危人群的新發糖尿病發生率[1-2]。利用RNA干擾技術阻斷血管緊張素轉換酶以及利用血管緊張素 Ⅱ(AngiotensinⅡ，Ang Ⅱ受體阻斷劑在細胞水平及動物實驗中均可以減少氧化應激及細胞凋亡，改善胰腺纖維化，增加胰島素分泌[3-5]。血管緊張素(1-7) [angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是RAS的重要成員之一，主要由Ang Ⅱ在血管緊張素轉換酶2的作用下生成，通過與其受體結合發揮擴血管、抗炎、抗組織纖維化、抗氧化應激等效應，與Ang Ⅱ作用相反[6-7]。已有研究表明，Ang-(1-7)可以促進葡萄糖攝取和脂質分解，改善胰島素抵抗及血脂異常[8]。

本研究即應用高脂高熱量飼料喂養結合小劑量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，給予Ang-(1-7)干預，觀察Ang-(1-7)對糖代謝、胰島素分泌功能、胰島素抵抗、氧化應激以及胰島β細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1動物模型制備及分組8周齡雄性Wistar大鼠，體重180 g～220 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。隨機選取12只為正常對照(NC)組，普通飼料喂養。24只給予高糖高脂高熱量飼料喂養，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，一周后非同日兩次尾靜脈采血測隨機血糖≥16.7 mmol/L為成模標準。成模大鼠20只隨機分為糖尿病對照組(D0組，n=10)、Ang-(1-7)干預組(D1組，n=10)。D1組以Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)頸部皮下注射，余兩組以等量的生理鹽水頸部皮下注射，共干預8周。

1.2檢測指標實驗前后測體重和空腹血糖(FPG)，每日觀察動物的食欲、活動力、體溫及其他反應情況。 實驗結束時ELISA法檢測血清Ang Ⅱ和空腹胰島素(fasting insulin，FINS)的濃度，計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA -IR)，HOMA-IR=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

1.3免疫組化檢測胰腺iNOS與Caspase-3蛋白表達做胰腺組織石蠟切片，每個大鼠每個指標選5張切片，iNOS與Caspase-3免疫組織化學染色，將每張切片隨機編號，在高倍(×400)鏡下雙盲觀察6～8個視野，選擇胰島部分用計算機圖像處理系統進行平均光密度值檢測，經校正后代表其蛋白的相對表達水平，并量化分析。1.4實時熒光定量PCR提取胰島β細胞總RNA，檢測iNOS、Bax、Bcl-2與Caspase-3的mRNA表達水平。基因擴增反應條件均為：94℃預變性10 min，94℃15 s，60℃60 s，擴增45個循環。引物序列見表1。

表1　引物序列

2結果

2.1Ang-(1-7)對大鼠FPG、體重、Ang Ⅱ、FINS及HOMA-IR的影響(見表2)干預結束后，D0組和D1組大鼠體重差異無統計學意義，但兩組體重均低于NC組。與NC組比較，D0組FPG、AngⅡ濃度、HOMA-IR明顯升高，FINS明顯減少。D1組與D0組相比，FPG、Ang Ⅱ、HOMA-IR降低，FINS增加。提示Ang-(1-7)治療降低RAS活性，增加血清胰島素含量，改善胰島素抵抗，發揮抗糖尿病作用。

表2　干預后各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、Ang Ⅱ的比較(±s)

2.2免疫組化結果胰島內iNOS與Caspase-3的表達水平(見圖1、表3)與NC組相比，D0組胰島iNOS相對表達量增加了77.1%，Caspase-3相對表達量增加了1.03倍。與D0組相比，D1組iNOS相對表達量降低了19.4%，Caspase-3相對表達量下降了37.2%。表明經Ang-(1-7)干預后，胰島內氧化應激降低，促凋亡蛋白表達下降。

圖1　胰島iNOS及Caspase-3免疫組化染色(×400)

表3　各組大鼠胰島免疫組化結果量化分析(±s)

2.3iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達水平(見表4)與NC組相比，D0組iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平分別增加了3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2mRNA表達水平降低了74.8%。與D0組相比，D1組iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平分別降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2mRNA表達水平增加了81.2%。表明經Ang-(1-7)干預后，促β細胞凋亡因子基因表達下降，抗凋亡因子基因表達增加。

表4　胰腺內iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA相對表達量(±s)

3討論

研究已證實胰腺組織內能表達完整的且具有功能活性的RAS成分，并參與胰島β細胞功能和存活的調節，與糖尿病時β細胞功能障礙的發生發展密切相關[9]。最新研究表明，胰腺存在RAS的重要成分Ang-(1-7)，可拮抗Ang Ⅱ的作用，Ang-(1-7)參與幾乎所有RAS系統的調節機制[10-13]，成為具有很大潛力的RAS干預靶點。

高糖時胰腺局部RAS過度表達，Ang Ⅱ生成增加，誘導胰島細胞產生過多的活性氧中間產物，一方面可能激活細胞內凋亡通路，誘導細胞凋亡，抑制胰島素的合成及釋放，最終導致胰島結構和功能損害，另一方面也可直接損害胰島β細胞[14-15]。本實驗也發現糖尿病大鼠血清Ang Ⅱ濃度增加，胰島局部iNOS及凋亡因子Caspase-3蛋白表達水平升高，同時血清胰島素濃度下降。通過給予Ang-(1-7)干預后發現，血清Ang Ⅱ濃度降低，胰島的iNOS及Caspase-3蛋白表達水平均減少，胰島素分泌增加。

2型糖尿病中胰島β細胞凋亡的主要信號途徑是線粒體途徑[16]，即促凋亡因子(如Bax、Bid等)和抗凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xl等)異常表達使線粒體外膜通透性增加，同時內膜里的細胞色素C釋放到細胞質，激活Caspase3、Caspase6、Caspase7，破壞細胞的結構和代謝，導致細胞凋亡。研究表明氧化應激是引起β細胞功能缺陷并加劇其惡化的主要原因，活性氧(ROS)類物質是細胞凋亡的重要介質，作用于線粒體凋亡途徑的各個環節。ROS既能上調Bax的表達，又能在Caspase級聯放大中起到重要作用[17-19]。本實驗發現2型糖尿病大鼠經Ang-(1-7)干預后，胰島中促凋亡因子Bax、Caspase-3基因表達降低，抗凋亡因子Bcl-2基因表達升高，由此可推測糖尿病狀態下拮抗RAS后，可通過下調iNOS的表達，降低胰島局部氧化應激水平，減少β細胞凋亡，對β細胞起到保護作用。

有研究證實在氧化應激時，可導致胰島素信號通路受阻，引發胰島素抵抗。研究表明RAS與胰島素抵抗關系密切，Ang Ⅱ可影響肝臟、肌肉和脂肪組織的胰島素受體、胰島素受體底物及葡萄糖轉運體4等，激活胰島素抵抗[20]。本實驗用Ang-(1-7)干預后，糖尿病大鼠胰島素抵抗指數降低，說明阻斷RAS可增加胰島素的敏感性。

STZ誘導的糖尿病大鼠Ang Ⅱ生成增多，胰腺局部氧化應激反應、促凋亡因子表達增加，抗凋亡因子表達下降，胰島素分泌減少，胰島素抵抗指數增加。Ang-(1-7)干預可減弱胰腺局部氧化應激反應，改善凋亡系統失衡，改善胰島素分泌功能及胰島素抵抗，發揮抗糖尿病作用。

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(本文編輯王雅潔)

基金項目：山西省自然科學基金(No.2009011056-2)；山西省衛生和計劃生育委員會科技攻關項目(No.201201074)；山西省高校“131”領軍人才工程

通訊作者：李興，E-mail：13007000339@163.com

中圖分類號：R587R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.015

文章編號：1672-1349(2016)13-1488-04

(收稿日期：2016-05-11)