六種菌懸液制備方法的探討

2016-08-10 00:18:51陳雪芳吳艷麗

大科技 2016年2期

陳雪芳吳艷麗

（蘇州景昱醫療器械有限公司 215123）

六種菌懸液制備方法的探討

陳雪芳吳艷麗

（蘇州景昱醫療器械有限公司 215123）

依照《中國藥典》2015年版四部標準，在無菌檢查法和微生物限度檢查法等試驗中，經常需要接種小于100cfu的各種試驗菌作為測試，而制備該濃度的菌懸液需要有可靠的方法，以確保制備的菌懸液能滿足試驗所需。為了得到精確的菌懸液含菌量，特對此制備方法進行驗證。

制備方法；菌懸液；梯度稀釋

1 試驗材料

1.1 儀器設備

本次試驗所用主要儀器設備：生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器、生化培養箱、霉菌培養箱、電子天平、電熱鼓風干燥箱等，試驗用儀器設備經國家計量檢測部門檢定合格，并在有效期之內。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，由中國食品藥品檢定研究院提供，菌株代次為第2代。

1.3 稀釋劑

0.9 ％無菌氯化鈉溶液。

1.4 培養基

胰酪大豆胨液體培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基，均由青島高科園海博生物技術有限公司生產，在使用有效期內，且已通過培養基適用性檢查。

2 試驗方法

2.1 接種及培養

（1）接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物至10ml胰酪大豆胨液體培養基中，每種試驗菌各接種5支，用接種環分別刮取斜面培養物1次、2次、3次、4次、5次，并在培養基管作好標記，于 30～35℃培養 18～24h。

（2）接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml沙氏葡萄糖液體培養基中，共接種5支，用接種環分別刮取斜面培養物1次、2次、3次、4次、5次，并在培養基管作好標記，于20～25℃培養24～48h。

（3）接種黑曲霉的新鮮培養物至10ml沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面上，培養基斜面長度應不超過試管總長度的1/2，共接種5支，用接種環分別刮取斜面培養物1次、2次、3次、4次、5次并在斜面劃線，作好標記，于 20～25℃培養 5d。

2.2 梯度稀釋

2.2.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌培養物

將上述培養管置于規定溫度培養至規定時間后，在旋渦混合器上將菌液混勻，每種用無菌吸管吸取1ml菌液，用若干支含9ml的0.9％無菌氯化鈉溶液逐級梯度稀釋，稀釋至10-5、10-6、10-7、0-8梯度，每個梯度分別取2ml至2個無菌平皿中，每皿1ml。每稀釋一個梯度，必須換一個無菌吸頭，并且每個梯度菌液必須混勻。

2.2.2 黑曲霉瓊脂斜面培養物

加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用雙層紗布過濾菌絲的方法吸出1ml孢子懸液，用若干支裝量為9ml/支的含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液逐級梯度稀釋至10-5、10-6、10-7梯度，每個梯度分別取2ml至2個無菌平皿中，每皿1ml。每稀釋一個梯度，必須換一個無菌吸頭，并且每個梯度菌液必須混勻。

2.3 菌液計數

細菌培養傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，于30～35℃培養3d。真菌培養傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，于20～25℃培養5d。

2.4 判定標準

在5次獨立平行試驗中，選擇菌落數＜100cfu/ml的稀釋級別作為驗證試驗及日常檢驗之用。