飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長及非特異免疫的影響

鐘國防吳國忠張明輝

（1. 上海海洋大學水產與生命學院， 上海 201306； 2. 中國科學院上海應用物理研究所， 上海 201216；3. 上海市水產技術推廣站， 上海 200433）

飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長及非特異免疫的影響

鐘國防1吳國忠2張明輝3

（1. 上海海洋大學水產與生命學院， 上海 201306； 2. 中國科學院上海應用物理研究所， 上海 201216；3. 上海市水產技術推廣站， 上海 200433）

實驗研究殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長性能及非特異性免疫能力的影響。在飼料中分別添加0、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的殼聚糖季銨鹽， 制成5組等氮等能飼料。將900尾［初體質量（3.82±0.34） g］健康的凡納濱對蝦隨機分成5組（45尾×4平行）， 養殖時間56d。結果表明：飼料中添加殼聚糖季銨鹽顯著影響凡納濱對蝦的生長， 0.15%實驗組凡納濱對蝦的增重率和特定生長率最佳（P＜0.05）。飼料中添加殼聚糖季銨鹽0.1%、0.15%和0.20%能顯著提高凡納濱對蝦血清溶菌酶和堿性磷酸酶及酚氧化酶的活性（P＜0.05）。飼料中添加殼聚糖季銨鹽可顯著提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染的能力（P＜0.05）， 0.15%組的保護效果最好， 其相對免疫保護率為33.24%。殼聚糖季銨鹽能顯著提高凡納濱對蝦的生長性能和抗病能力， 本實驗條件下適宜的添加量為0.15%。

凡納濱對蝦； 殼聚糖季銨鹽； 生長性能； 抗病力； 副溶血弧菌

凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）又名南美白對蝦， 是目前我國重要的養殖品種。近年來因抗逆性強的良種缺乏， 在集約化養殖過程中通常會由于養殖水質惡化而發病率很高， 養殖成功率不斷降低。同時， 養殖生產中使用防病藥物較多， 造成病原體耐藥問題， 也可能造成養殖商品蝦藥物殘留，影響食用安全。與其他的水生魚類相比， 凡納濱對蝦免疫反應比較原始， 免疫能力主要來自于非特異性的防御機能［1］， 提高其非特異性免疫力是提高養殖成活率的重要途徑。因此， 尋找一種綠色、安全、環保的免疫增強劑是目前凡納濱對蝦養殖中亟待解決的問題。目前， 已有學者在這方面做了大量的研究， 結果發現， 殼聚糖不但能提高水產動物存活率和生長性能， 還能提高水產動物免疫力， 并且具有無殘留、無抗藥性等特點［2］， 是一種良好的免疫增強劑。Wang等［3］研究發現對凡納濱對蝦腹血竇注射4 μg/g體重的殼聚糖， 可以增強其免疫能力和對溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）感染的抵抗能力。殼聚糖（Chitosan）又稱甲殼質、殼多糖， 是唯一一種陽離子動物纖維和堿性多糖， 它可以通過水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、鹵化、氧化、還原、縮合和絡合等反應， 生成各種具有不同性能的殼聚糖衍生物［4］。殼聚糖季銨鹽（Chitosan quaternary ammonium salt）是為了克服殼聚糖溶解性不足而進行的季銨鹽化改性的重要衍生物， 分子量小、比殼聚糖更易溶于水， 目前已在農業、食品、醫藥、紡織和生物醫學工程等領域得到了廣泛應用［5］。它不僅具有良好的生物相容性、抗菌抑菌， 而且來源豐富、價格經濟， 對取代抗生素等水產用藥物或免疫促進劑有廣闊前景。目前有關殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長、免疫及機體經殼聚糖免疫強化后的抗感染能力的系統研究還沒有相關報道。

本研究通過在凡納濱對蝦飼料中添加不同濃度的殼聚糖季銨鹽， 觀察其生長性能及血清中與非特異免疫相關的幾種重要酶活性的變化來分析免疫酶活性與抗菌能力的相互關系， 采用人工注射副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）感染的方法， 統計累計死亡率來進一步驗證殼聚糖季銨鹽在提高免疫力方面的作用效果， 為殼聚糖季銨鹽的在凡納濱對蝦中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及實驗飼料

在飼料中添加0、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的殼聚糖季銨鹽， 制成5組等氮等能飼料（表 1）。殼聚糖季銨鹽由中國科學院上海應用物理研究所提供， 飼料原料購自杭州海皇生物科技有限公司。原料經粉碎后過80目篩， 用絞肉機制粒（粒徑2.5 mm）， 風干后-20℃儲存備用。實驗共分為5個組， 將900尾［初體質量（3.82±0.34） g］健康凡納濱對蝦隨機分成5組（45尾×4平行）， 養殖時間56d。

表 1 飼料配方及營養組成表（干物質基礎）Tab. 1 Ingredients and proximate compositions of experimental diets （DM basis） （% ）

1.2 養殖管理

選擇健壯且體型勻稱的對蝦先暫養兩周， 稱取900尾蝦隨機放入20個網箱（2 m×1.2 m×1.2 m）中，每個網箱45尾。實驗共分5個實驗組， 每組4個平行。每天投喂兩次（07：00和18：00）， 日投飼量為蝦體重的3%—5%， 每兩周取樣稱重調整投飼量， 每周測定水質指標， 養殖期間水溫21—28℃， 溶解氧5.2—10.12 mg/L， 氨氮0—0.2 mg/L， 亞硝酸鹽0—0.1 mg/L。養殖實驗持續56d。

1.3 樣品采集

養殖試驗結束后， 停食24h取樣， 每尾蝦稱重后，每平行取15尾蝦的血淋巴液， 用肝素鈉（125 U/ mL）防止凝固。同一平行的血淋巴液混合放入3個2 mL離心管中， 離心（10min， 8 000 r/min， 4℃）分離血清備用。取肝胰臟和肌肉置于-20℃冰箱中保存待測。

1.4 測定指標和方法

實驗期結束后撈出網箱中蝦， 計數稱重， 并計算成活率、增重、飼料系數及特定生長率， 計算方法如下：

成活率（Survival ratio， %）=100×試驗結束時尾數/試驗開始時尾數；

增重 （Weight gain， WG， g）=末體重-初始體重；

飼料系數（Feed conversion ratio， FCR）=（投料量-殘餌量）/（末體重-初始體重+死亡體重）；

特定生長率（SGR， %/d） =100×（ln終末體重-ln初始體重）/實驗天數。

飼料營養成分測定：水分測定用105℃常壓干燥法， 粗灰分測定用550℃灼燒法， 粗蛋白質測定用杜馬斯燃燒法［6］， 粗脂肪測定用氯仿-甲醇法［7］， 每個樣品測3個重復。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD，黃嘌呤氧化酶法）， 堿性磷酸酶（ALP）采用南京建成生物工程研究所（江蘇， 南京）購試劑盒測定。1個超氧化物歧化酶（SOD）活力單位（U）定義為每毫升血清中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量。堿性磷酸酶（AKP）： 1個單位（U）定義為每毫升血清在37℃與基質作用15min產生1 mg酚。酚氧化酶活力參照Ashida［8］和陳乃松［9］的方法稍加調整測定， 以實驗條件下每分鐘光密度值增加0.001為1個活性單位（U）。

1.5 攻毒實驗

生長實驗結束后， 每個平行取15尾蝦， 進行攻毒實驗。從腹腔注射0.05 mL（濃度為1.0×108cell/ mL）副溶血弧菌懸濁液進行人工感染， 對照組注射等劑量PBS緩沖液， 攻毒后各組分別繼續投喂相應的實驗飼料或基礎飼料， 及時撈出死亡對蝦， 記錄死亡數量和死亡時間， 12d 后結束感染實驗。攻毒所用副溶血弧菌菌種由上海海洋大學（張慶華）實驗室提供， 將菌株擴大培養后， 用滅菌生理鹽水洗脫，然后用法國梅里埃公司生產的濁度儀調到實驗所需濃度。

1.6 數據處理

實驗數據用SPSS 17.0 軟件進行單因子方差分析（one-way ANOVA， LSD）， 若存在顯著差異則進行Duncan多重比較。所有統計值均以平均值±標準差（Mean±SD）表示， 顯著水平定為P＜0.05。

表 2 飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長性能的影響Tab. 2 Effects of adding chitosan quaternary ammonium salt in diets on the growth performance of Litopenaeus vannamei

2 結果

2.1 飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長性能的影響

殼聚糖季銨鹽能顯著影響凡納濱對蝦的生長性能， 實驗組平均尾增重顯著高于對照組（P＜0.05），0.15%實驗組增重最大， 比對照組提高了21.28%。各實驗組特定生產率（SGR）均顯著高于對照組，0.15%實驗組SGR最佳P＜0.05）。0.15%和0.20%的殼聚糖季銨鹽能顯著降低飼料系數（F C R）（P＜0.05），且0.15%低于對照組和各實驗組； 添加量為0.05%和0.10%的實驗組攝食量有所增加， 但與對照組沒有顯著差異（P＞0.05），但0.15%和0.20%組攝食量顯著低于對照組（P＜0.05）； 殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦的成活率（SR）顯著提高（P＜0.05）， 但添加量為0.15%和0.20%的實驗組成活率不再出現顯著差異（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦非特異性免疫能力的影響

由表 3可知， 0.05%的殼聚糖季銨鹽實驗組與對照組血清溶菌酶的活性沒有顯著差異（P＞0.05），但0.10%、0.15%和0.20%的實驗組溶菌酶的活性顯著高于對照組 （P＜0.05）， 0.15%和0.20%兩個實驗組之間溶菌酶的活性沒有顯著性差異（P＞0.05）。0.05%的殼聚糖季銨鹽實驗組與對照組血清超氧化物歧化酶的活性沒有顯著差異（P＞0.05）， 但0.10%、0.15%和0.20%的實驗組超氧化物歧化酶的活性顯著高于對照組 （P＜0.05）， 0.15%和0.20%兩個實驗組之間超氧化物歧化酶的活性沒有顯著性差異（P＞0.05）。0.05%的殼聚糖季銨鹽實驗組與對照組血清堿性磷酸酶的活性沒有顯著差異（P＞0.05）， 但0.10%、0.15%和0.20%的實驗組堿性磷酸酶的活性顯著高于對照組 （P＜0.05）， 0.15%和0.20%兩個實驗組之間堿性磷酸酶的活性沒有顯著性差異（P＞0.05）。殼聚糖季銨鹽能顯著提高凡納濱對蝦血清酚氧化酶的活性（P＜ 0.05）， 且0.15%顯著高于其他各實驗組。

表 3 飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦非特異性免疫能力的影響Tab. 3 Effects of adding chitosan quaternary ammonium salt in diets on nonspecific immunity of Litopenaeus vannamei

表 4 凡納濱對蝦被副溶血弧菌感染后的累積死亡率Tab. 4 Cumulative mortality of L. vannamei challenged with V. parahaemolytics （%）

2.3 飼料中添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦攻毒后死亡率影響

由表 4可知， 感染副溶血弧菌后的第1天開始有蝦死亡， 但前3天的死亡率都沒有顯著性差異（P＞0.05）， 從感染后第4天開始死亡率加速， 對照組的死亡率顯著高于添加了殼聚糖季銨鹽的實驗組。對照組在感染后的第10 天死亡率為100%， 顯著高于各實驗組（P＜0.05）。添加殼聚糖季銨鹽的各實驗組在感染后的第9天死亡率基本趨于穩定， 到第11天， 殼聚糖季銨鹽添加量為0.10%、0.15%和0.20%的3個實驗組凡納濱對蝦不再死亡。實驗結果表明， 投喂0.05%、0.10%、0.15%和0.20%等不同梯度的殼聚糖季銨鹽飼料可顯著提高凡納濱對感染副溶血弧菌后的存活率（P＜0.05）， 其免疫相對保護率分別為（6.67±6.67）%、（11.11±3.84）%、（33.33±6.67）%和（31.11±3.84）%， 當添加量達0.15%后效果顯著。

3 討論

3.1 殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長性能的影響

殼聚糖作為水產動物飼料添加劑， 可以降低餌料系數， 提高水生動物的生長性能。具體機制主要是通過改善腸道微生態環境， 促進動物消化吸收，提高飼料利用率。Ouattara等［10］認為殼聚糖可吸附菌體細胞壁上的帶負電荷物質（如脂多糖、磷壁脂酸）， 緩沖動物機體酸性內環境， 使菌體細胞壁破損，抑制細菌生長繁殖 ； 殼聚糖也能吸附或螯合進入腸道內的重金屬及其他有害物質， 將其排出體外，以降低對生長的不良影響［11， 12］。在本實驗中隨著添加量的增加存活率逐漸提高， 可能與殼聚糖能調節脂肪代謝， 減少脂肪肝病的發生相關。殼聚糖能與膽汁酸絡合，促使血液和肌肉中的膽固醇轉化成膽汁酸， 從而降低膽固醇的濃度； 或者與脂肪、脂肪酸和膽固醇等脂類物質結合成絡和物， 由于其產物有強疏水性， 且不能被胃酸水解， 不被消化系統吸收， 而隨糞便排出［13］。目前有關殼聚糖在異育銀鯽（Carassiusauratusgibelio）和暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）的研究中發現， 飼料中添加不同濃度的殼聚糖可以提高腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性， 從而可促進生長性能［14， 15］。殼聚糖在甲殼動物上的應用研究表明， 其適宜的添加量隨養殖對象的不同而有差異。Tan等在克氏原螯蝦（Procamgbarusclarkii）研究中發現， 飼料中添加不同濃度的殼聚糖其特定生長率呈先升高后降低的趨勢， 以1.0%殼聚糖添加組最高［16］， 而Niu等［17］在凡納濱對蝦的研究表明， 飼料中添加2 g/kg（0.2%）的殼聚糖就可顯著提高對蝦的生長性能。對于同一種蝦， 其適宜的添加量則會隨殼聚糖形式不同而有差異。本實驗結果表明， 殼聚糖季銨鹽在凡納白對蝦中的最適添加量為0.15%， 與Niu等［17］認為的2 g/kg（0.2%）并不一致， 這主要是殼聚糖季銨鹽通過改性后分子量變小、更易溶于水， 其相關的性能優于殼聚糖所致。本實驗結果還表明， 當殼聚糖季銨鹽超過0.15%后， 生長性能并沒有繼續提高， 這主要是因為殼聚糖作為甲殼素脫乙酰基后的多糖類產物， 一定量的殼聚糖被蝦吸收利用后可促進其幾丁質酶的分泌， 使其順利蛻殼生長［18］， 過量添加會因殼聚糖具有很強的吸附蛋白質或離子的能力， 導致必需的營養物質被其吸附而降低消化吸收能力， 從而影響其生長［19］。

3.2 殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦非特性免疫能力的影響

凡納濱對蝦屬于甲殼動物， 其免疫能力主要依靠天然的可誘導的非特異性免疫防御系統， 包括細胞免疫及體液免疫因子［20， 21］。殼聚糖作為重要的免疫增強劑在對蝦非特異性免疫方面發揮著重要作用， 其具體的內在調節機制主要包括以下兩方面：（1）調節機體血細胞總數， 激活體液免疫因子，提高存活率和抗感染力； （2）調控對蝦體液免疫因子的基因表達量， 進而增強相關免疫因子的活性， 最終提高對蝦的非特異性免疫防御能力［22］。Wang和Chen［23］通過對凡納濱對蝦體內注射4 μg/g體重的殼聚糖， 結果發現實驗組免疫能力和對溶藻弧菌感染的抵抗能力顯著高于對照組。在本實驗中當殼聚糖季銨鹽添加量為0.10%、0.15%和0.20%時， 可顯著提高凡納濱對蝦血清中溶菌酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶的活性。溶菌酶是凡納濱對蝦體液免疫因子之一， 它不僅能增強機體巨噬細胞吞噬能力和消化功能， 還能破壞和消除侵入體內的異物， 從而實現機體的免疫防御［24］。在本研究中， 當殼聚糖季銨鹽的添加量大于0.10%時可以顯著提高血清溶菌酶活性， 而低濃度組血清溶菌酶活性與對照組沒有差別。胡琳琳等［25］在凡納濱對蝦飼料中添加殼聚糖硫酸鹽結果發現， 0.15‰和0.50‰的殼聚糖硫酸鹽添加組對蝦的溶菌酶和酚氧化酶活性均得到顯著提高。酚氧化酶是對蝦體內參與免疫反應的主要酶類之一， 它在一定刺激下即可被激活并產生一系列生物活性物質， 促進血細胞的吞噬和包裹作用最終提高免疫力［26］。研究表明極微量的多糖成分就可激活酚氧化酶原激活系統［27］。在本研究中， 飼料中殼聚糖季銨鹽的添加量在0.05%—0.20%， 凡納濱對蝦血清酚氧化酶活性隨著添加量增大而增高， 這說明殼聚糖季銨鹽也能激活酚氧化酶原激活系統， 可以顯著提高對蝦血淋巴中的酚氧化酶活力。超氧化物歧化酶通過清除超氧陰離子自由基（O-2）在機體的氧化與抗氧化平衡中起著重要作用， 進而保護細胞免受損傷。目前有關多糖類免疫增強劑對凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶活力影響的研究結果存在較大差異。在本研究中， 殼聚糖季銨鹽可以提高對蝦血清超氧化物歧化酶活性， 但添加量過高其活性反而下降。張明等［28］用脂多糖注射到中國明對蝦體中， 結果發現血清的超氧化物歧化酶活力顯著高于對照組。王秀華等［29］在凡納濱對蝦飼料中添加肽聚糖， 結果發現添加量過高或過低， 其血清超氧化物歧化酶活性均略低于對照組， 但與對照組的差異不顯著； 而日本囊對蝦（Penaeusjaponicus）飼料中添加肽多糖， 對血清超氧化物歧化酶活性并不產生影響［30］。造成這些結果的差異除了養殖品種和養殖環境的不同外， 可能與飼料中維生素C的含量有關， 因為維生素C為抗氧化劑， 也可以清除體內超氧陰離子自由基［31］。堿性磷酸酶是組成溶酶體酶的重要部分， 直接參與磷酸化代謝和轉移， 同時又在DNA和蛋白質和脂類代謝過程中發揮重要作用［32］。陳國福等［33］在研究中發現飼料中添加肽聚糖可提高凡納濱對蝦血清中堿性磷酸酶的活性， 同時育苗水體中加入肽聚糖對幼體非特異性免疫水平有顯著的提升。同樣在本實驗中當殼聚糖季銨鹽添加量達到0.10%時即可顯著提高凡納濱對蝦血清中堿性磷酸酶的活性。綜上所述， 根據凡納濱對蝦免疫相關酶活性的變化可以證明在飼料中添加殼聚糖季銨鹽可提高凡納濱對蝦免疫力， 這與李云華等［34］在克氏原螯蝦中的研究結果相似。此外， 毛文敏等［35］在克氏原螯蝦的研究中還發現殼聚糖可以在一定程度上起到抵抗低溫應激的作用， 有效防止免疫功能降低。

3.3 殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦抗感染能力的影響

水生動物攻毒后成活率是衡量其疾病抵抗力的重要指標， 而疾病抵抗力可反映出營養物質對機體免疫調節作用的效果。Anderson等［36］在給北美溪鱒注射和浸泡殼聚糖28d后進行攻毒實驗， 最后發現兩種處理方式的成活率分別為60%和50%。他認為主要原因是機體受殼聚糖刺激后， 類似于異物入侵從而激活體內的免疫應答系統， 使機體能更有效的抵抗即將入侵的病原體。Rajeshkumar等［37］將含有白斑病毒VP28基因的DNA片段放入殼聚糖納米粒中飼喂凡納濱對蝦， 結果發現， 凡納濱對蝦對白斑病毒的抵抗力顯著提高， 成活率明顯上升。在本實驗中以副溶血弧菌對實驗蝦進行攻毒試驗， 結果發現， 添加不同梯度的殼聚糖季銨鹽可顯著提高對凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染的能力， 在攻毒后第4天添加殼聚糖季銨鹽組累計死亡率開始顯著性低于對照組， 至實驗結束后累計死亡率0.15%添加量組最低為66.67%， 對照組為100%。這表明經殼聚糖季銨鹽免疫強化后的凡納濱對蝦也可以有效抵抗副溶血弧菌的感染能力， 這也進一步論證了殼聚糖季銨鹽可提高機體免疫功能， 保障存活率。

綜上， 在本實驗條件下， 綜合考慮殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長性能、免疫相關酶活及抗副溶血弧菌感染的能力的影響， 建議殼聚糖季銨鹽的最適添加量為0.15%， 飼料中過多添加殼聚糖季銨鹽對凡納濱對蝦生長及非特異免疫力的作用效果反而不佳， 其具體原因還有待進一步研究。

［1］Wang L， Li G Y. Research progress of humoral immune in crustaceans ［J］. Marine Sciences， 1992， （3）： 18—19 ［王雷， 李光友．甲殼動物的體液免疫研究進展. 海洋科學，1992， （3）： 18—19］

［2］Xiao W W， Feng L， Liu Y， et al. Effects of chitosan on immune function of aquatic animals and its possible regulation mechanism ［J］. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2010， 22（3）： 544—550 ［肖偉偉， 馮琳， 劉揚， 等. 殼聚糖對水生動物免疫能力的影響及其可能的調節機制.動物營養學報， 2010， 22（3）： 544—550］

［3］Wang S H， Chen J C. The protective effect of chitin and chitosan against Vibrio alginolyticus in white shrimp Litopenaeus vannamei ［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2005， 19（3）： 191—204

［4］Liu G H， Zhang W J， Xie Z J. The function of chitosan biological activity and its application in animal production ［J］. China Feed， 2010， 23（6）： 27—29 ［劉國花， 張文舉， 謝正軍. 殼聚糖的生物學功能及其在畜牧生產中的應用. 中國飼料， 2010， 23（6）： 27—29］

［5］Hou Y J， Xu J， Zhou Y M， et al. Research progress of chitosan biological activity and its application in animal production ［J］. Feed Industry， 2015， 36（2）： 5—13 ［侯玉潔， 徐俊， 周瑤敏， 等. 殼聚糖的生物學活性及其在動物生產中的應用. 飼料工業， 2015， 36（2）： 5—13］

［6］Etheridge R D， Pesti G M， Foster E H. A comparison of nitrogen values obtained utilizing the Kjeldahl nitrogen and Dumas combustion methodologies （Leco CNS 2000）on samples typical of an animal nutrition analytical laboratory ［J］. Animal Feed Science and Technology， 1998，73（1）： 21—28

［7］Huang K， Wu H Y， Zhu D G， et al. Effects of dietary lipid levels on growth and fatty acid composition in hepatopancreas and muscle of pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei ［J］. Fisheries Science， 2011， 30（5）：249—255 ［黃凱， 吳宏玉， 朱定貴， 等. 飼料脂肪水平對凡納濱對蝦生長， 肌肉和肝胰腺脂肪酸組成的影響. 水產科學， 2011， 30（5）： 249—255］

［8］Ashida M. Purification and characterization of prophenoloxidase from the hemolymph of the silkworm Bombyx mori ［J］. Archives Biochemistry Biophysics， 1971， 144（2）：749—762

［9］Chen N S， Wei T T， Liao Y Z. Effects of housefly larva meal and β-glucanon growth and immunity of Litopenaeus vannamei ［J］. Journal of Fisheries of China， 2007，31（6）： 771—777 ［陳乃松， 魏濤濤， 廖奕招. 蠅蛆粉和β-葡聚糖對凡納濱對蝦生長和免疫的影響. 水產學報，2007， 31（6）： 771—777］

［10］Ouattara B， Simard R E， Piette G， et al. Inhibition of surface spoilage bacteria in processed meats by application of antimicrobial films prepared with chitosan ［J］. International Journal of Food Microbiology， 2000， 62（1）：139—148

［11］Wan Ngah W S， Teong L C， Hanafiah M. Adsorption of dyes and heavy metal ions by chitosan composites： A re-view ［J］. Carbohydrate Polymers， 2011， 83（4）： 1446—1456

［12］Varma A J， Deshpande S V， Kennedy J F. Metal complexation by chitosan and its derivatives： a review ［J］. Carbohydrate Polymers， 2004， 55（1）： 77—93

［13］Juang R S， Shao H J. A simplified equilibrium model for sorption of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan ［J］. Water Research， 2002， 36（12）： 2999—3008

［14］Chen Y， Zhou H Q， Leng X J， et al. Effects of chitosan on growth and digestive emzyme in allogynogenetic silver crucian carp ［J］. Journal of Fishery Sciences of China，2006， 13（3）： 440—445 ［陳勇， 周洪琪， 冷向軍， 等. 殼聚糖對異育銀鯽生長和消化酶的影響. 中國水產科學，2006， 13（3）： 440—445］

［15］Hua X M， Zhou H Q， Zhang Y F. Effect of dietary supplemental chitosan and probiotics on growth and some digestive enzyme activities in juvenile fugu obscurus ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 2005， 29（3）： 299—305 ［華雪銘， 周洪琪， 張宇峰， 等. 飼料中添加殼聚糖和益生茵對暗紋東方鲀幼魚生長及部分消化酶活性的影響. 水生生物學報， 2005， 29（3）： 299—305］

［16］Tan S H， Degnan B M， Lehnert S A. The penaeus monodonchitinase 1 gene is differentially expressed in the hepatopancreas during the molt cycle ［J］. Marine Biotechnology， 2000， 2（2）： 126—135

［17］Niu J， Liu Y J， Lin H Z， et al. Effects of dietary chitosan on growth， survival and stress tolerance of postlarval shrimp， Litopenaeus vannamei ［J］. Aquaculture Nutrition，2011， 17（2）： 406—412

［18］Ren X F， Zhou X， Zhang P， et al. The effects of dietary chitosan supplementation on the survival， serum biochemical indicators and non-specific immunity of Procambarus clarkia ［J］. Freshwater Fisheries， 2013， 43（3）：77—82 ［任秀芳， 周鑫， 張萍， 等. 殼聚糖對克氏原螯蝦存活、血清生化指標和非特異性免疫功能的影響. 淡水漁業， 2013， 43（3）： 77—82］

［19］Shiau S Y， Yu Y P. Dietary supplementation of chitin and chitosan depresses growth in tilapia， Oreochromisniloticus ×O. aureus ［J］ Aquaculture， 1999， 179（1—4）： 439—446

［20］Fan Y J. Researching progresses in shrimp non specific immunity and disease control ［J］. Marine Sciences， 2002，26（4）： 26—31 ［樊廷俊. 對蝦非特異性免疫與對蝦疾病監控的研究進展. 海洋科學， 2002， 26（4） ： 26—31］

［21］Smith V J， Ratcliffe N A. Cellular defense reactions of the shore crab， Carcinusmaenas： invivo hemocytic and histopathological responses to injected bacteria ［J］. Invertebrate Pathology， 1980， 35（3）： 65—74

［22］Zhang J. Effects of dietary immunostimulants on growth，non-specific immune response and stress resistance of juvenile pacific white shrimp， Litopenaeus vannamei ［D］. Thesis for doctor of Science. Sun Yat-sen University，Guangzhou. 2012 ［張健. 免疫增強劑對凡納濱對蝦幼蝦生長、免疫及抗應激的影響. 博士學位論文， 中山大學.廣州. 2012］

［23］Wang S H， Chen J C. The protective effect of chitin and chitosan against Vibrio alginolyticus in white shrimp Litopenaeus vannamei ［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2005， 19（3）： 191—204

［24］Sonomi M， Jun-ichi H， Ikuo H. Expressionofjapanceseflounderc-typelysozyme cDNA in insect cells ［J］. Developmental & Comparative Immunology， 2001， 25（5—6）：439—445

［25］Hu L L， Fang W H， Gao L J， et al. Study on enhancement of Litopenaeus vannamei relied upon oral administration of chitosansulfate to resist the infection of white spots Yndrome virus ［J］. MarineFisheries， 2008， 30（3）：45—50 ［胡琳琳， 房文紅， 高露姣， 等. 殼聚糖硫酸酯提高凡納濱對蝦抗白斑綜合征病毒感染力的研究. 海洋漁業， 2008， 30（3）： 45—50］

［26］Xiao K Y， Deng S M， Xiang J G. The Immunization and Application of Aquatic Animals ［M］. Beijing： Science Press. 2007， 139—142 ［肖克宇， 鄧時銘， 向建國. 水生動物免疫與應用. 北京： 科學出版社. 2007， 139—142］

［27］Wang X F， Fan Y J， Cong R S， et al. Effects of several immunostimulants on the number，ultrastructure of hemocytes and the yield， activities of phenoloxidase in Penaeus chinensis ［J］. Journal of Fisheries of China， 2005，29（1）： 66—73 ［汪小鋒， 樊廷俊， 叢日山， 等. 幾種免疫促進劑對中國對蝦血細胞數量、形態結構以及酚氧化酶產量和活性的影響. 水產學報， 2005， 29（1）： 66—73］

［28］Zhang M， Wang L， Guo Z Y， et al. Effect of lipopolysaccharide and Vibrio anguillarum on the activities of phosphatase， superoxide dismutase and the content of hemocyanin in the serum of Fenneropenaeus chinesis ［J］. Marine Sciences， 2004， 28（7）： 22—25 ［張明， 王雷， 郭振宇，等. 脂多糖和弧菌對中國對蝦血清磷酸酶、超氧化物歧化酶和血藍蛋白的影響. 海洋科學， 2004， 28（7）：22—25］

［29］Wang X H， Song X L， Huang J. Effects of peptidoglycan （PG） preparation on humoral immune factors of Litopenaeus vannamei ［J］. Journal of Fishery Sciences of China， 2004， 11（1）： 26—30 ［王秀華， 宋曉玲， 黃倢. 肽聚糖制劑對南美白對蝦體液免疫因子的影響. 中國水產科學， 2004， 11（1）： 26—30］

［30］Wang X H， Song X L， Huang J. Effect of peptidoglycan preparation on the relative non-specific immune factors in hemolymph of shrimp， Marsupenaeus japonicas ［J］. High Technology Letters， 2004， 14（5）： 78—81 ［王秀華， 宋曉玲， 黃倢. 肽聚糖制劑對日本對蝦非特異免疫因子的作用. 高技術通訊， 2004， 14（5）： 78—81］

［31］Ai C X， Chen L Q， Gao L J. Effect of vitamin C on SOD，ALP and ACP activitiesof Chinese mitten-handed crab，Eriocheir sinensi ［J］. Journal of Oceanography in Taiwan Strait， 2002， 21（4）： 431—438 ［艾春香， 陳立僑， 高露姣，等. Vc對河蟹血清和組織中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影響. 臺灣海峽， 2002， 21（4）： 431—438］

［32］Zhou J， Song X L， Huang J， et al. Effect ofA 3α peptidoglycan on different tissues of superoxide dismutase and phosphatase activity in Paralichthys olivaceus ［J］. Journal of Fishery Sciences of China， 2004， 11（4）：296—301 ［周進， 宋曉玲， 黃倢， 等. A3α肽聚糖對牙鲆不同組織中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影響， 中國水產科學， 2004， 11（4） ： 296—301］

［33］Chen G F， Zhang C G， Wang G Y， et al. Effect of A3α peptidoglycan on acid phosphatase and alkaline phosphatase activities in larval white leg shrimp Litopenaeus vannamei ［J］. Fisheries Science， 2008， 27（11）： 584—587［陳國福， 張春云， 王光玉， 等. A3α肽聚糖對凡納濱對蝦幼體酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響. 水產科學，2008， 27（11）： 584—587］

［34］Li Y H， Li T Y， Huang J F， et al. Effects of chitosan on enzyme activities related to immune function in Procamgbarus clarkia ［J］. China Feed， 2009， （20）： 28—30 ［李云華， 李太元， 黃金鳳， 等. 殼聚糖對克氏原螯蝦幾種免疫相關酶活性的影響. 中國飼料， 2009， （20）： 28—30］

［35］Mao W M， Liu Q， Xu J， et al. Effect of chitosan on low temperature antistress to Procambarus clarkia ［J］. Hubei Agricultural Sciences， 2013， 52（9）： 2111—2113 ［毛文敏，劉晴， 徐靜， 等. 殼聚糖對克氏原螯蝦抗低溫應激的影響. 湖北農業科學， 2013， 52（9）： 2111—2113］

［36］Anderson D P， Siwicki A K. Duration of protectionagainst Aeromonas salmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection orimmersion ［J］. The Progressive Fish Culturist， 1994， 56： 258—261

［37］Rajeshkumar S， Venkatesan C， Sarathi M， et al. Oral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles to protect the shrimp from white spots yndrome virus （WSSV） ［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2009， 26（3）：429—437

EFFECTS OF ADDING CHITOSAN QUATERNARY AMMONIUM SALT IN DIETS ON THE GROWTH PERFORMANCE AND NONSPECIFIC IMMUNITY OF LITOPENAEUS VANNAMEI

ZHONG Guo-Fang1， WU Guo-Zhong2and ZHANG Ming-Hui3
（1. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China； 2. Shanghai Institute of Applied Physics， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201216， China； 3. Shanghai Fisheries Technical Extension Station， Shanghai 200433， China）

The current study investigated growth performance， nonspecific immunity of white shrimp （Litopenaeus vannamei） by supplementation of chitosan quaternary ammonium salt in diets with graded levels of 0 （control group），0.05%， 0.10%， 0.15% and 0.20% chitosan quaternary ammonium salt. Each diet was randomly fed to four cages of white shrimp with initial average weight （3.82±0.34） g in 20 cages （2.5 m×1.5 m×1 m） for 8 weeks. The result showed that the chitosan quaternary ammonium salt addition significantly improved growth performance with the best effect of weight gain and SGR in 0.15% group. The activity of lysozyme， alkaline phosphatase and phenol oxidase were significantly increased in the 0.1%， 0.15% and 0.20% trial groups （P＜0.05）. Chitosan quaternary ammonium salt effectively improved the ability of shrimp to resist the Vibrio parahaemolytics's infection （P＜0.05） with the best performance in 0.15% trial group that is 33.24%. These data indicate that chitosan quaternary ammonium salt can significantly improve the growth performance and the ability resisting infection， and the optimum amount under current experimental condition is 0.15%.

Litopenaeus vannamei； Chitosan quaternary ammonium salt； Growth performance； Resistance to disease；Vibrio parahaemolytics

S963.7

A

1000-3207（2016）04-0712-08

10.7541/2016.94

2015-12-29；

2016-03-25

上海市科技興農重點攻關項目［滬農科攻字（2014）第3-8號］； 水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心（ZF1206）資助 ［Supported by Shanghai Science and Technology Key Project for Promoting Agriculture （20140308）； Shanghai University Knowledge Service Platform Project （ZF1206）］

鐘國防（1974—）， 男， 湖南臨武人； 博士研究生； 主要研究方向為水產動物營養和水產健康養殖技術。E-mail： gfzhong@shou.edu.cn