飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚生長、免疫-抗氧化功能及血清抗菌性能的影響

王 壇華雪銘， 2朱偉星， 3陳曉明吳 釗孔 純焦建剛何亞丁王 剛

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 2. 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 3. 白銀賽諾生物科技有限公司， 上海 200122）

飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚生長、免疫-抗氧化功能及血清抗菌性能的影響

王 壇1華雪銘1， 2朱偉星1， 3陳曉明1吳 釗1孔 純1焦建剛1何亞丁1王 剛1

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 2. 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 3. 白銀賽諾生物科技有限公司， 上海 200122）

為研究在飼料中添加不同水平的溶菌酶制品對(duì)吉富羅非魚（GIFT， Oreochromis niloticus）生長性能、免疫-抗氧化功能和血清抗菌性能的影響， 選用平均體重為（11.35±0.08）g的吉富羅非魚960尾， 隨機(jī)分為6組（每組4個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)40尾）， 分別投喂基礎(chǔ)飼料（對(duì)照組）和5種添加水平分別為18、36、54、72和90 mg/kg溶菌酶制品的試驗(yàn)飼料， 養(yǎng)殖周期為60d。結(jié)果表明： （1） 54 mg/kg溶菌酶添加組魚的生長性能和飼料利用情況最優(yōu)， 增重率和蛋白質(zhì)效率均顯著高于對(duì)照組， 飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）； 肝體比隨溶菌酶添加水平的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 90 mg/kg添加組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）； 脾臟指數(shù)在36和54mg/kg添加組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）； 全魚粗蛋白和粗灰分含量在54 mg/kg添加組均呈現(xiàn)較高水平， 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。（2）溶菌酶添加水平對(duì)羅非魚的免疫-抗氧化能力產(chǎn)生影響， 54和72 mg/kg添加水平能顯著提高魚體血清和肝臟的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性， 降低丙二醛含量（P＜0.05）； 肝臟溶菌酶活性在54和72 mg/kg添加組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 而血清溶菌酶活性隨溶菌酶添加水平的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（L90組除外）， 顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。（3）血清抗菌試驗(yàn)顯示， 54和72 mg/kg溶菌酶添加組羅非魚對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌的抑制能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 而對(duì)枯草芽孢桿菌的抵抗能力最低， 比對(duì)照組分別低34.71%和42.21% （P＜0.05）。結(jié)果表明， 在本試驗(yàn)條件下， 在吉富羅非魚飼料中添加54 mg/kg溶菌酶制品可以改善其生長性能； 當(dāng)添加水平為54和72 mg/kg時(shí)， 羅非魚的免疫-抗氧化能力和血清抗菌性能均得到了顯著提高。

吉富羅非魚； 溶菌酶； 生長； 免疫-抗氧化功能； 抗菌性能

羅非魚是世界性優(yōu)良養(yǎng)殖品種之一， 在我國華南地區(qū)有廣泛的養(yǎng)殖。近年來， 隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展， 包括羅非魚在內(nèi)的一些魚類養(yǎng)殖環(huán)境逐漸遭到惡化并滋生大量病原菌， 嚴(yán)重影響了魚類的生長和機(jī)體健康。盡管使用抗生素類藥物能在一定程度上緩解養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的上述問題，但與此同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生藥物殘留、機(jī)體耐藥性以及破壞水生動(dòng)物微生態(tài)平衡等一系列不良問題， 對(duì)食品安全和人類健康構(gòu)成了潛在威脅［1， 2］。因此， 尋找和開發(fā)一種和抗生素具有相似功能， 將其應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖過程中又不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響的抗生素替代品， 將成為解決上述問題的關(guān)鍵。

溶菌酶是機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的重要酶類， 廣泛分布于動(dòng)植物組織、體液和分泌物中， 主要通過破壞菌體細(xì)胞壁的肽聚糖而使之裂解死亡， 是包括魚類在內(nèi)的生物體非特異性免疫防御系統(tǒng)中的重要組成部分［3， 4］。迄今為止， 已從多種動(dòng)植物組織和分泌物中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶， 其對(duì)細(xì)菌、真菌和某些病毒表現(xiàn)出了不同程度的抗性［5， 6］。此外， 溶菌酶因具有無毒［7］、無殘留［8］和耐熱性強(qiáng)［9， 10］等優(yōu)點(diǎn)而成為一類應(yīng)用前景廣闊的綠色飼料添加劑。研究表明， 在肉仔雞［11， 12］、肉鴨［13］、斷奶仔豬［14， 15］等飼糧中添加溶菌酶后對(duì)家畜家禽有促生長和提高抗病力的作用。然而， 試驗(yàn)動(dòng)物的消化生理特點(diǎn)、生活環(huán)境與飼料加工工藝的不同，以及魚的種屬差異性， 均可能造成溶菌酶制品不同的應(yīng)用效果。Chen等［16］在飼料中添加溶菌酶顯著提高了異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的生長性能和免疫調(diào)控能力； 而邢思華等［17］研究發(fā)現(xiàn)， 飼料中添加溶菌酶雖未提高草魚（Ctenopharyngodon idellus）的生長性能， 但明顯提高了其抗感染能力。

吉富羅非魚（GIFT， Oreochromis niloticus）盡管在食性上與異育銀鯽同屬于雜食性， 但其消化道結(jié)構(gòu)與異育銀鯽和草魚大不相同， 屬于典型的有胃魚類。本試驗(yàn)選用吉富羅非魚為研究對(duì)象， 在其基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的溶菌酶制品， 研究該溶菌酶制品以口服方式進(jìn)入羅非魚體后對(duì)其生長、免疫-抗氧化功能和血清抗菌性能的影響， 旨在為溶菌酶制品在有胃魚飼料中的合理利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

根據(jù)NRC， 2011中羅非魚的營養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)配方， 以魚粉、豆粕、花生粕和菜籽粕為主要蛋白源， 以魚油和豆油為主要脂肪源， 配制成粗蛋白、粗脂肪和總能水平分別為35.41%、5.77%和22.87 kJ/g的基礎(chǔ)飼料， 在此基礎(chǔ)上分別添加0、18、36、54、72和90 mg/kg的溶菌酶制品（上海沈李科工貿(mào)有限公司； 初始酶活性為5×103U/mg）， 分別記為L0（對(duì)照組）、L18、L36、L54、L72和L90。飼料原料粉碎過40目篩， 微量成分采用逐級(jí)擴(kuò)大的方法添加，與大宗原料均勻混合后用制粒機(jī)（SLP-45， 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所）制成粒徑為2.0 mm的硬顆粒飼料， 風(fēng)干后放于-20℃冰箱冷藏備用。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

吉富羅非魚來源于上海海洋大學(xué)羅非魚育苗場(chǎng)， 經(jīng)繁育后暫養(yǎng)于室外水泥池中， 用基礎(chǔ)飼料馴化2周， 使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。選擇活潑健康、規(guī)格一致、平均體重為（11.35±0.08） g的吉富羅非魚幼魚960尾， 隨機(jī)分成6組， 置于長方形水泥池的尼龍網(wǎng)箱（1.2 m×1.8 m×1.2 m）中， 每組設(shè)4個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)40尾。水源為120目篩絹過濾后的天然河水。試驗(yàn)期間投喂各組相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)飼料， 前2周按魚體重的6%—8%投喂， 之后為魚體重的3%—5%， 于8：00、12：00和17：00分3次投喂， 并參照前一天的攝食情況做適當(dāng)調(diào)整。養(yǎng)殖期間24h充氣， 使晝夜溶氧＞5 mg/L， 定期換水和吸污， 使氨氮含量＜0.3 mg/ L， 水溫26—34℃， 飼養(yǎng)周期為60d。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

生長指標(biāo) 試驗(yàn)結(jié)束后， 禁食24h， 對(duì)各重復(fù)試驗(yàn)魚稱重并計(jì)數(shù)， 用以統(tǒng)計(jì)成活率（Survival rate，SR）、增重率（Weight gain rate， WGR）和飼料系數(shù)（Feed conversion ratio， FCR）。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取15尾魚， 用150 mg/L的丁香酚水溶液將其快速麻醉，詳細(xì)記錄其中5尾魚的體重、體長、脾臟重、肝臟重和頭腎重量， 用以計(jì)算各器官占體重的百分比，以指數(shù)計(jì)。各組試驗(yàn)魚的生長指標(biāo)根據(jù)以下公式計(jì)算求得：

成活率（SR， %）=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)

增重率（WGR， %）=100×［終末均重（g）-初始均重（g）］/初始均重（g）

飼料系數(shù)（FCR）=攝入飼料總量（g）/［終末體重（g）-初始體重（g）］

蛋白質(zhì)效率（PER， %）=100×［終末體重（g）-初始體重（g）］/攝入蛋白量（g）

肥滿度（CF， %）=100×體重（g）/［體長（cm）］3

肝體指數(shù)（HSI， %）=100×肝臟重（g）/魚體重（g）

脾臟指數(shù)（SSI， %）=100×脾臟重（g）/魚體重（g）

頭腎指數(shù)（HKI， %）=100×頭腎重（g）/魚體重（g）

常規(guī)營養(yǎng)成分 每重復(fù)取2尾魚用于全魚營養(yǎng)成分分析。飼料和全魚樣品中常規(guī)營養(yǎng)成分的測(cè)定部分參照AOAC （2000）的方法。其中， 飼料水分采用105℃烘箱干燥恒重法測(cè)定， 全魚水分采用冷凍干燥法測(cè)定； 飼料和全魚粗蛋白含量采用凱氏定氮法（總氮×6.25）測(cè)定； 粗脂肪含量采用氯仿甲醇提取法測(cè)定； 粗灰分含量采用馬弗爐550℃高溫灼燒法測(cè)定； 總能水平的測(cè)定采用氧彈式熱量計(jì)法。

血清和肝臟免疫-抗氧化相關(guān)指標(biāo) 分別從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取吉富羅非魚10尾， 經(jīng)150 mg/L的丁香酚水溶液快速麻醉后， 用肝素化的無菌注射器自尾靜脈采血， 血樣在4℃冰箱中靜置4h后，4000 r/min離心10min制備血清。采血后， 解剖其中8尾魚的肝臟組織， 所有樣本分裝后， -20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（%， 風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab. 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for GIFT tilapia （%， air-dry basis）

取適量解凍后的肝臟組織， 用預(yù)冷的生理鹽水（0.86%）漂洗， 濾紙拭干， 稱重， 放于玻璃勻漿管中，按1∶9 （m∶v）比例加入生理鹽水， 用玻璃勻漿機(jī)勻漿。勻漿液在4℃下4000 r/min離心10min， 取上清液待測(cè)。血清直接取自保存于-20℃冰箱中的樣本解凍后待測(cè)。

溶菌酶（LZM）活性采用冰浴終止法測(cè)定。稀釋樣品與底物（溶壁微球菌粉， 南京建成生物工程研究所）在冰水浴中混勻后于570 nm處測(cè)定透光度（T樣品0）， 然后37℃水浴30min， 隨后立即置于冰水浴中終止反應(yīng)10min， 于570 nm處測(cè)定透光度（T樣品），利用反應(yīng)前后濁度的變化定義溶菌酶的活力大小。計(jì)算公式： 溶菌酶活性A（U/mL）=［（T樣品-T樣品0）/ （T標(biāo)準(zhǔn)-T標(biāo)準(zhǔn)0）］×標(biāo)準(zhǔn)管酶活力（溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品， 南京建成生物工程研究所）。

總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

肝臟組織樣本上清液中總蛋白含量的檢測(cè)采用考馬斯亮藍(lán)法， 使用南京建成生物工程研究所提供的蛋白定量測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。

肝臟LZM、T-SOD、CAT活性及MDA含量定義為每mg總蛋白中含有的單位數(shù)。

血清抗菌活性 選擇革蘭氏陽性菌（G+）中的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及革蘭氏陰性菌（G-）中的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、大腸桿菌（Escherichia coli）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）進(jìn)行抗菌試驗(yàn)。各菌種均來源于上海海洋大學(xué)病原庫。其中， 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基中； 枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基中； 嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（后者加入1%的NaCl）中［18］。挑取1—2 mm的新鮮單一菌落接種在5 mL相適宜的液體培養(yǎng)基中（上述）， 于搖床中以200—250 r/min的速度， 30℃條件下培養(yǎng)16h， 并調(diào)整菌懸液的濃度值為A600=0.5 （麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)）［19］。

血清抗菌活性的測(cè)定參考Sunyer和Tort［20］的方法并略有改動(dòng)。取100 μL細(xì)菌稀釋液（1/10）于96微孔板中， 立即加入相等體積的血清樣本， 與此同時(shí)，以只加入血清的微孔作為陰性對(duì)照， 以只加入細(xì)菌稀釋液的微孔作為陽性對(duì)照， 在30℃條件下孵育24h， 每小時(shí)記錄一次吸光度值（A650）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）， 若存在顯著性差異， 則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較， P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響

表 2 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響Tab. 2 Effects of dietary lysozyme supplementation on growth performance of GIFT tilapia

在養(yǎng)殖試驗(yàn)期間， 各重復(fù)組成活率均達(dá)到100%。由表 2可知， L54組魚的終末體重、增重率和蛋白質(zhì)效率均達(dá)到最大值， 且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 其他組魚的末均重和增重率略高于對(duì)照組或與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）； 與此同時(shí)，L36、L72和L90組魚的蛋白質(zhì)效率也顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。除L18組外， 其余各添加組魚的飼料系數(shù)均低于對(duì)照組， L54組魚的飼料系數(shù)最低（P＜0.05）， 其他組與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）；肝體比在L90組魚顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， L36-L72組雖低于對(duì)照組， 但無顯著性差異（P＞0.05）； 脾臟指數(shù)在L36和L54組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， 其余各組與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）； 而在肥滿度和頭腎指數(shù)上， 各組魚均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚體成分的影響

由表 3可知， 飼料溶菌酶添加水平對(duì)吉富羅非魚全魚水分和粗脂肪含量無顯著性影響（P＞0.05），而對(duì)全魚粗蛋白和灰分含量產(chǎn)生影響。L18、L54 和L90組羅非魚的粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）； L54組全魚的粗灰分含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚免疫-抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

由表 4可知， 飼料溶菌酶水平對(duì)吉富羅非魚血清和肝臟的免疫-抗氧化指標(biāo)均產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。血清中， L18、L36、L54和L72組魚的溶菌酶（LZM）活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， 而L90組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）； 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性在L54、L72和L90組均顯著高于對(duì)照組和其他各組（P＜0.05）， 分別在L72和L54組有最大值； 丙二醛（MDA）含量在L54組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， 在L72和L90組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 其他各組無顯著性差異（P＞0.05）。肝臟中， L54和L72組魚的LZM和SOD活性均顯著高于對(duì)照組和其他各組（P＜0.05）； MDA含量在L54組顯著低于對(duì)照組和其他各組（P＜0.05）；CAT活性在L54、L72和L90組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， L18、L36組與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。綜上分析可看出， 用含不同溶菌酶添加水平的飼料喂養(yǎng)吉富羅非魚60d后， L54、L72和L90組魚的血清免疫-抗氧化系統(tǒng)處于激活狀態(tài)， 主要表現(xiàn)在與免疫和抗氧化相關(guān)的酶活上； 丙二醛含量在L54組有較低水平， 但在L72和L90組出現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。與此同時(shí)， 肝臟的免疫-抗氧化相關(guān)指標(biāo)在L54和L72組也呈現(xiàn)較高水平。

2.4 血清抗菌活性

由表 5可知， 用含不同溶菌酶添加水平的飼料喂養(yǎng)吉富羅非魚60d后， 各組魚的血清對(duì)試驗(yàn)菌種表現(xiàn)出了不同的抑制能力。從整體水平上看，L54和L72組魚的血清對(duì)大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）和溶藻弧菌（V. alginolyticus）的抑制能力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 并對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出了最大的抑制作用； 對(duì)于枯草芽孢桿菌（B. subtilis）而言， 各組魚血清對(duì)其的抑制能力總體低于其他受試菌種， 且L36-L90組對(duì)該菌的抑制能力顯著低于對(duì)照組和L18組（P＜0.05）， 其中， L54和L72組表現(xiàn)出了最低的抗菌活力， 與對(duì)照組相比分別降低34.71%和42.21%（P＜0.05）。

表 3 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚體成分的影響Tab. 3 Effects of dietary lysozyme supplementation on body composition of GIFT tilapia （%）

表 4 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶活性和丙二醛含量的影響Tab. 4 Effects of dietary lysozyme supplementation on SOD， CAT， LZM activity and MDA content of GIFT tilapia

表 5 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚血清抗菌活性的影響Tab. 5 Effects of dietary lysozyme supplementation on serum antimicrobial activity of GIFT tilapia （%）

3 討論

3.1 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚生長性能和飼料利用的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 溶菌酶制品添加水平在36—90 mg/kg時(shí)， 吉富羅非魚的增重率和蛋白質(zhì)效率總體呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)， 飼料系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（相較于對(duì)照組）， 其中， 54 mg/kg添加水平下吉富羅非魚表現(xiàn)出了最佳的生長效果， 但在高劑量添加水平下， 羅非魚的增重和飼料利用又呈現(xiàn)出略微下降的趨勢(shì)， 說明該溶菌酶制品在適宜添加范圍內(nèi)可改善吉富羅非魚的生長和飼料利用， 但是添加水平過高可能降低其促生長作用。隨溶菌酶添加水平的提高， 肝體比在組間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 90 mg/kg添加組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， 說明飼用溶菌酶有助于對(duì)貪食性魚類患脂肪肝等脂肪蓄積性疾病的預(yù)防， 這可能源于溶菌酶具有類似消化酶的功能［21， 22］，使得溶菌酶飼料組的羅非魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收（未發(fā)表數(shù)據(jù)）和對(duì)飼料的利用率有不同程度的提高， 因此促進(jìn)了魚體生長并降低了肝臟負(fù)擔(dān)。抗菌實(shí)驗(yàn)表明， 添加較高水平的溶菌酶（54和72 mg/kg）能夠保護(hù)芽孢桿菌在羅非魚體內(nèi)的生長和繁殖， 而對(duì)金黃色葡萄球菌等有害菌起到了較強(qiáng)的抑制作用， 推測(cè)該溶菌酶制品對(duì)羅非魚的促生長作用還可能與機(jī)體內(nèi)群落多樣性的降低有關(guān)， 從而集中更多的能量用于生長。

3.2 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚體成分的影響

在本試驗(yàn)中， 溶菌酶添加組魚的粗蛋白和粗灰分含量總體呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)（L72組除外）， 可能原因在于飼料中添加溶菌酶后有利于魚體對(duì)蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及其在機(jī)體中的合成與沉積， 相關(guān)研究結(jié)果已在畜禽動(dòng)物上得到證實(shí)［23—25］。另一方面， 當(dāng)添加水平為54和90 mg/kg時(shí)， 羅非魚的肝體比均有下降趨勢(shì)， 而全魚粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 說明在此投喂水平和養(yǎng)殖環(huán)境下， 為確保機(jī)體的正常生長， 羅非魚更多地動(dòng)用了肝臟中的脂肪源作為能源物質(zhì)， 以緩解可能存在的食物限制對(duì)魚類生長和營養(yǎng)價(jià)值方面的不良影響［26］。目前， 有關(guān)溶菌酶制品添加到飼料中對(duì)魚體成分的影響僅見于異育銀鯽［16］， 關(guān)于此方面的問題有待進(jìn)一步研究。

3.3 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚免疫-抗氧化能力的影響

魚類屬于低等的變溫脊椎動(dòng)物， 其特異性免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善， 主要依靠自身的非特異性免疫來抵抗病原生物的入侵［27］。溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）是魚類免疫防御和抗氧化體系中的重要組成部分， 在免疫應(yīng)答和抗氧化過程中起著不可忽視的作用。LZM可清除其他抗菌因子作用后所剩余的細(xì)菌細(xì)胞壁并增強(qiáng)其他免疫因子的抗菌敏感性［28］； SOD具有清除機(jī)體過多氧自由基的功能， 能夠維持機(jī)體免受氧化損傷， 且SOD與生物的免疫水平密切相關(guān)， 能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能［29］；CAT對(duì)于清除超氧化物歧化酶歧化超氧陰離子自由基（O2-）產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）起著重要作用， 和SOD具有相類似的生物學(xué)功能［30］。本研究表明， 在飼料中添加54、72和90 mg/kg溶菌酶能顯著提高吉富羅非魚的血清SOD和CAT活性， 這與邢思華等［17］在草魚中研究結(jié)果相類似， 并認(rèn)為溶菌酶進(jìn)入魚體后對(duì)內(nèi)源性免疫酶（SOD和ALP）有激活作用。Chen等［16］在異育銀鯽飼料中添加溶菌酶后并沒有提高血清SOD的活性， 然而攻毒后血清中的SOD活性顯著提高， 這可能與魚的種類和自身反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的不同有關(guān)， 但上述結(jié)果都能說明飼料中添加一定量的溶菌酶可以改變魚體的免疫狀態(tài)。MDA是脂質(zhì)過氧化物的主要分解產(chǎn)物， 具有很強(qiáng)的生物毒性， MDA含量升高與氧自由基產(chǎn)生過多密切相關(guān)［31］。當(dāng)溶菌酶添加水平為54 mg/kg時(shí)， 血清MDA含量最低， 但是72和90 mg/kg添加組又顯著高于對(duì)照組， 結(jié)合肝臟SOD分析可知， L90組魚的SOD活性較低， 因此累積的MDA可能代謝進(jìn)入血液循環(huán)， 從而使該組魚血清中的MDA含量升高， 這可能與魚體的自我調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。肝臟作為魚體的代謝活動(dòng)中心， 其免疫-抗氧化水平的變化對(duì)于整個(gè)機(jī)體免疫-抗氧化軸系功能的發(fā)揮具有重要作用。研究結(jié)果表明， 飼料中添加54和72 mg/kg溶菌酶顯著提高了吉富羅非魚肝臟中的LZM、SOD和CAT活性， 并且MDA含量在L54組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）， 說明該飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝臟的免疫-抗氧化功能起到了積極的調(diào)控作用。與此同時(shí)， 血清LZM活性隨添加水平的提高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（L90組除外）， 這可能由于添加溶菌酶后降低了魚體的菌群多樣性（未發(fā)表數(shù)據(jù)）， 從而削弱了機(jī)體自身的免疫活化［16， 32， 33］。研究表明， 當(dāng)溶菌酶進(jìn)入魚體后， 主要通過抑制內(nèi)環(huán)境葡萄球菌科等的繁殖，使腸道菌群多樣性降低， 進(jìn)而通過削弱和阻斷病原體相關(guān)分子模式與識(shí)別受體之間的相關(guān)聯(lián)系而使機(jī)體自身免疫活化水平降低； 然而在肝臟中呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)， 這又可能與肝臟較為獨(dú)立的局部微循環(huán)有關(guān)。研究表明， 大多通過門靜脈入肝的病原體可跳過脾臟和淋巴系統(tǒng)， 直接與肝臟免疫系統(tǒng)相互作用， 并在肝臟中形成一個(gè)局部免疫微環(huán)境［34］。

3.4 飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚血清抗菌性能的影響

在魚類血清中含有豐富的非特異性體液因子，是抵抗外來病原菌入侵的一道重要屏障［35］。因而，血清抗菌活性的大小可作為表征魚類免疫功能的一項(xiàng)直接指標(biāo)［36］。本試驗(yàn)結(jié)果表明， 各組魚的血清均能抑制試驗(yàn)菌的生長速度， 但不同的添加水平存在較大的差異。在較高劑量添加水平下， L54、L72和L90組魚的血清對(duì)大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄球菌（S. aureus）的抑制能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）， 而低劑量添加組與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。于此同時(shí)， 高劑量添加組魚的免疫-抗氧化相關(guān)酶活性也顯著高于對(duì)照組， 說明機(jī)體抗菌性能的發(fā)揮與其免疫-抗氧化水平密切相關(guān)［37］； 而免疫和抗氧化功能的有效調(diào)節(jié)也得益于試驗(yàn)魚相對(duì)高效的飼料利用率， 為免疫-抗氧化系統(tǒng)的功能發(fā)揮提供了營養(yǎng)保障［38］。嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）是淡水魚類中常見的條件致病菌； 溶藻弧菌（V. alginolytcus）是海水中的一種嗜鹽性弧菌， 能夠引起多種魚類的創(chuàng)傷性感染［39］， 二者均屬革蘭氏陰性菌（G-）。在本試驗(yàn)條件下， 各組魚血清對(duì)這兩種菌的抑制作用均呈現(xiàn)一個(gè)先升后降的變化趨勢(shì)， 這可能是由于過高劑量（90 mg/kg）的溶菌酶進(jìn)入魚體后產(chǎn)生的排異行為， 在一定程度上削弱了其抗菌性能，因此降低了對(duì)弧菌科的抵抗作用［40］。另一方面， 在溶菌酶制品同一添加水平條件下， 各組魚血清對(duì)S. aureus的抑制作用更大， 其原因是溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果要明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌［41， 42］。而各組魚的血清對(duì)枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的抑制作用明顯低于其他各菌種， 這可能與溶菌酶制品的選擇性抑菌性能有關(guān)， 研究表明溶菌酶對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑菌作用， 而對(duì)諸如芽孢桿菌科的有益菌則無抑制能力或抑制能力較弱［16， 43］。

4 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下， 在吉富羅非魚飼料中添加54 mg/kg溶菌酶制品可以改善其生長性能； 當(dāng)添加水平為54和72 mg/kg時(shí)， 羅非魚的免疫-抗氧化能力和血清抗菌性能均有顯著提高。

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EFFECTS OF DIETARY LYSOZYME SUPPLEMENTATION ON GROWTH PERFORMANCE， IMMUNE-ANTIOXIDANT CAPACITY AND SERUM ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF GIFT TILAPIA （OREOCHROMIS NILOTICUS）

WANG Tan1， HUA Xue-Ming1， 2， ZHU Wei-Xing1， 3， CHEN Xiao-Ming1， WU Zhao1， KONG Chun1，JIAO Jian-Gang1， HE Ya-Ding1and WANG Gang1
（1. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China； 2. Key Laboratory of Genetic Resources for Freshwater Aquaculture and Fisheries， Ministry of Aquaculture， Shanghai 201306， China； 3. Bai Yin Sino Bio-science Co.， Ltd， Shanghai 200122， China）

To investigate effects of dietary lysozyme supplementation on growth performance， immune-antioxidant capacity and antibacterial properties of GIFT tilapia （Oreochromis niloticus）， basal diet or basal diet added with 18， 36，54， 72 or 90 mg/kg lysozyme were formulated for a 60 days experiment. The results showed that the 54 mg/kg lysozyme addition group had the best growth and feed efficiency in which weight gain rate and protein efficiency ratio increased and feed conversion ratio decreased significantly compared with the control group （P＜0.05）. Lysozyme supplementation decreased hepatosomatic index with significant difference in 90 mg/kg group compared with the control group （P＜0.05）. Spleen-somatic index was significantly lower in 36 mg/kg and 54 mg/kg groups compared with that of the control group （P＜0.05）. Crude protein and ash content in whole body in 54 mg/kg group were significantly higher than that of the control group （P＜0.05）. Lysozyme supplementation in 54 and 72 mg/kg group increased serum and liver superoxide dismutase and catalase activity but significantly decreased malondialdehyde content compared with the control group （P＜0.05）. Liver lysozyme activity in 54 and 72 mg/kg group was significantly higher than that of the control group， while serum lysozyme activity in groups except L90 group was significantly lower than that of the control group （P＜0.05）. Serum antibacterial test showed more resistance to Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Aeromonas hydrophila， Vibrio alginolyticus in 54 and 72 mg/kg group compared with the control group but more sensitive to Bacillus subtilis with a 34.71% and 42.21% reduction， respectively. These results indicated that diet lysozyme supplementation （such as 54 mg/kg） can improve GIFT tilapia growth performance by regulating immune-antioxidant capacity of tilapia and improving serum antibacterial properties.

GIFT tilapia； Lysozyme； Growth performance； Immune-antioxidant capacity； Antimicrobial activity

S963.73

A

1000-3207（2016）04-0663-09

10.7541/2016.89

2015-07-20；

2016-01-14

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2012B091100372）； 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-49-04B）； 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206）資助 ［Supported by Ministry of Education of Guangdong Province University-industry Cooperation Project （2012B091100372）； China Agriculture Research System （CARS-49-04B）； Shanghai Collaborative Innovation Center for Aquatic Animal Genetics and Breeding （ZF1206）］

王壇（1988—）， 女， 河北晉州人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料。E-mail： wangtan0818@163.com

華雪銘（1974—）， 女， 副教授， 碩士生導(dǎo)師； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與免疫。E-mail： xmhua@shou.edu.cn