廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞增殖及對運動遷移能力的調控作用

李超柱，陳艷輝，陳艷華，黎丹戎（.欽州學院，廣西 欽州 535000；.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 5300；3.廣西醫科大學生命科學研究院，廣西 南寧 5300）

?

廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞增殖及對運動遷移能力的調控作用

李超柱1，陳艷輝1，陳艷華2，黎丹戎3，*
（1.欽州學院，廣西 欽州 535000；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學生命科學研究院，廣西 南寧 530021）

摘 要：目的：研究廣西牡蠣活性肽對卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞（SKOV3-PM4）的增殖及運動遷移能力的抑制作用。方法：采用四甲基偶氮唑藍（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法測定廣西牡蠣活性肽作用24 h后對細胞增殖的抑制作用。細胞經不同質量濃度的廣西牡蠣活性肽處理后，采用細胞計數法和集落形成實驗測定細胞增殖能力；細胞劃痕實驗和Transwell小室測定細胞體外運動和侵襲遷移能力。結果：MTT實驗結果顯示牡蠣活性肽質量濃度在5～80 mg/L范圍內抑制SKOV3-PM4的增殖，24 h的半數抑制濃度（inhibitory concentration 50%，IC50）為35.36 mg/L。細胞劃痕實驗表明無細胞毒性的質量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽能抑制SKOV3-PM4的增殖能力，牡蠣活性肽作用SKOV3-PM4細胞后其侵襲、遷移能力降低，與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）。結論：從牡蠣中分離出的小分子多肽在一定質量濃度下對SKOV3-PM4細胞的生長增殖、運動遷移具有抑制作用。

關鍵詞：牡蠣活性肽；卵巢癌；淋巴結轉移；細胞遷移

引文格式：

李超柱， 陳艷輝， 陳艷華， 等.廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞增殖及對運動遷移能力的調控作用［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 199-203.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613036. http://www.spkx.net.cn

LI Chaozhu， CHEN Yanhui， CHEN Yanhua， et al.Bioactive peptide derived from oyster meat from Guangxi region， China inhibits proliferation and migration of human ovarian carcinoma cells with directional high lymphatic metastasis［J］.Food Science， 2016，37（13）: 199-203.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613036. http://www.spkx.net.cn

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，盡管手術技巧的提高可以最大限度地切除腫瘤，以及鉑類、紫杉醇類和二線化療藥物治療的臨床應用，給患者帶來了生機。但是卵巢癌患者的5 a生存率仍無明顯提高，其原因主要是70%以上的卵巢癌患者初次確診時腫瘤已發生轉移，尤其是淋巴結轉移，從而喪失最佳治療時機。腫瘤轉移成為卵巢癌患者的主要致死因素［1-3］，因此防治腫瘤的浸潤與轉移在腫瘤的治療過程中具有重要的意義。

廣西欽州有豐富的海產品，從海洋天然活性物質尋找具抗腫瘤作用的物質，尤其從海洋生物中的蛋白水解物中發現結構特異、活性獨特的抗腫瘤活性多肽，篩選和開發新型的抑制惡性腫瘤轉移和預防的保健食品，是延長腫瘤患者壽命的重要途徑之一［4］。課題組前期采用動物復合酶為工具酶水解牡蠣蛋白，獲得了分子質量為1 000～3 000 D的牡蠣活性肽［5-6］，為了進一步探索其抗腫瘤轉移的活性及作用機制，本研究以自行構建的具有淋巴結定向高轉移潛能的卵巢癌細胞株SKOV3-PM4為實驗對象，通過觀察該活性肽對細胞增殖和遷移能力的影響，為臨床抗腫瘤轉移保健品的研發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株、材料與試劑

卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞系（SKOV3-PM4）按參考文獻［7］的方法自行構建。

廣西牡蠣活性肽由課題組前期分離獲得，分子質量為1 000～3 000 D［5］。

RPMI 1640培養基 美國Hyclon公司；胎牛血清 美國Gibco公司；纖連蛋白（fibronectin，FN）、Transwell穿膜小室、人工基膜基質凝膠Matrigel 美國Corning Costar公司；四氮甲基偶氮唑藍（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設備

5810R超低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣活性肽對細胞生長影響的檢測

取對數生長期的SKOV3-PM4細胞，調整細胞數為1×105個/mL，按每孔100 μL細胞懸液接種于96 孔板中。細胞貼壁后，設置不同質量濃度的牡蠣活性肽（質量濃度分別為5、10、20、40、80 mg/L）和空白對照組（僅加入相應體積培養基），每組設3 個復孔。在細胞培養箱中培養24 h后，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxid，DMSO）100 μL，在酶標儀上用測定490 nm波長處的光密度（optical density，OD）值，計算抑制率及半數抑制濃度（inhibitory concentration 50%，IC50）。計算公式［8］如下。

選取抑制率小于10%的質量濃度作為活性測定的質量濃度。

1.3.2 細胞遷移能力的檢測

取對數生長期的細胞，分別接種于6 孔板中，每孔2×105個細胞。待細胞貼壁后，棄去舊的培養基，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2 次，沿孔的縱行直徑劃痕，并在該劃痕左右0.5 cm處各劃1 條。細胞設置2 組，分別為4 mg/L牡蠣活性肽處理組和空白對照組。將孔板置于37 ℃，含5% CO2的無菌培養箱中培養，分別在0、12、24、48 h將孔板置于顯微鏡下觀察并拍攝圖片記錄劃痕處細胞的遷移情況。

1.3.3 細胞生長曲線的繪制

取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，細胞密度為1×105個/mL。各組細胞接種于24 孔板中，每孔100 μL，設3 個復孔。實驗組加入質量濃度為4 mg/L牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養基。從接種當日起，每日同一時間從培養箱中取出細胞，胰酶消化細胞，計數板計數，共計數7 d，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 集落形成實驗

將對數生長期的SKOV3-PM4細胞，以1 000 個/孔的密度接種于6 孔板，每孔2 mL，每組平行設3 個復孔；實驗組加入質量濃度為4 mg/L牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養基。將細胞置于37 ℃、5% CO2無菌條件下培養14 d，中途觀察細胞狀態換培養液，終止培養后PBS洗滌3 次，甲醇固定后，PBS洗滌3 次，Giemsa染色，以＞50 個細胞做為1 個集落，光學顯微鏡計數集落數并拍照。

1.3.5 細胞體外侵襲能力測定

取SKOV3-PM4對數生長期的細胞，將細胞濃度調整至5×104個/mL，取各組細胞懸液200 μL分別接種于上層小室內，小室下室加入含有 20% 胎牛血清的RPMI 1640完全培養基。在實驗組上層小室中加入質量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養基。37℃、5% CO2無菌孵育24 h后取出濾膜，擦去Matrigel膠，甲醇固定20 min，Giemsa染色。顯微鏡觀察并計數穿膜細胞數。

1.4 數據統計

采用SPSS 16.0統計學軟件對各實驗結果數據進行分析，用±s表示；組間比較用方差分析，以P＜0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細胞生長的影響

多肽作用24 h后MTT法檢測的結果（表1）表明，在5～80 mg/L質量濃度范圍內牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細胞增殖具有抑制作用，并且隨著質量濃度的增加，抑制作用逐漸增強，成劑量依賴性（P＜0.05）。牡蠣活性肽作用于SKOV3-PM4細胞24 h的IC50值為35.36 mg/L。

注：*.與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）。下同。

由圖1可知，從第2天起，加入牡蠣活性肽的SKOV3-PM4細胞生長狀態受到明顯抑制，4～7 d的細胞數明顯少于空白對照組（P＜0.05），表明牡蠣活性肽具有抑制SKOV3-PM4細胞增殖的功能。

2.2 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗檢測空白對照組和牡蠣活性肽處理組（4 mg/L）中SKOV3-PM4細胞在0、12、24、48 h時的遷移狀況。由圖2可知，牡蠣活性肽能抑制SKOV3-PM4細胞的遷移，經處理后的SKOV3-PM4細胞遷移能力較弱，成時間依賴性。

2.3 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細胞集落形成能力的影響

細胞集落形成實驗結果如圖3所示，加入牡蠣活性肽（4 mg/L）的細胞集落形成數為（168.33±11.63） 個，明顯低于空白對照組的（259.67±65.83） 個（P＜0.05）。

2.4 牡蠣活性肽對細胞體外侵襲能力

由圖4可知，加入牡蠣活性肽（4 mg/L）的細胞穿膜細胞數為（13±2）個，明顯低于空白對照組的（46.0±4.6）個，說明經牡蠣活性肽處理的SKOV3-PM4體外侵襲能力顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

近年來研究發現在牡蠣酶解的過程中存在大量的小分子活性肽，牡蠣活性肽具有分子質量小、毒性低、活性高、易于穿透腫瘤細胞等特點，越來越多的研究顯示，牡蠣活性肽有明顯抑制腫瘤細胞增殖的作用，如余杰等［9］檢測牡蠣活性肽（bioactive peptidesof oyster，BPO）誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用機制，結果表明：BPO誘導HeLa細胞凋亡的效應主要通過對細胞周期阻滯和激活細胞凋亡信號通路來實現；BPO的作用機制與誘導凋亡基因Caspase3 mRNA表達上調和細胞周期（G0/G1期）阻滯有關。廖共山等［10］發現牡蠣活性肽BPO G50-Ⅱ在一定濃度下對人舌鱗癌細胞株（Tca8l13）體外增殖具有抑制作用，并能誘導其發生凋亡。梁盈等［11］報道從牡蠣分離提取出的牡蠣低分子多肽，對肺癌A549細胞具有一定的誘導分化作用，能夠改變人肺腺癌細胞的惡性形態與超微結構特征。李鵬等［12］從牡蠣中提取得到牡蠣活性肽BPO-1，發現其對胃癌BGC-823細胞具有顯著的誘導凋亡作用。本研究再次證實了牡蠣活性肽對卵巢癌淋巴結高轉移細胞（SKOV3-PM4）的增殖具有明顯的抑制能力。

細胞運動能力的強弱與細胞的功能密切相關，因此檢測細胞運動能力在發育生物學、神經生物學、特別是癌癥的轉移生物學等領域都具有重要研究意義［13-16］。到目前為止，用于細胞運動能力評估的主要實驗方法有：體外組織移植、細胞集落形成實驗、劃痕實驗和Transwell法。細胞劃痕實驗是一種較常用的簡單的檢測細胞運動能力的方法，適合用于檢測貼壁生長的腫瘤細胞的遷移能力［17-19］。Transwell小室又稱插入式細胞培養皿，分為上下兩室，中間是一層帶有微孔的聚碳酸酯膜，孔徑大小規格不等，介于0.1～12.0 μm之間，膜上的微孔可作為細胞運動的通道，也是上下室中細胞之間物質交換以及信息傳遞的通道［20］。由于該實驗可以較好模擬腫瘤細胞生長和信息交換的環境，本研究選用技術成熟的劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗研究卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力，為實驗結果的可靠程度提供一定的保障。

卵巢癌發病隱匿，大多數患者就診時已是晚期，并伴隨著局部和遠處轉移，病人的預后差，病死率位于婦科腫瘤的首位［21-23］。目前對于卵巢癌，尤其淋巴結轉移的患者無特效藥物，因此從天然產物中篩選出活性高、毒性低的抗腫瘤化合物，具有重要且現實的意義［24-25］。從本研究結果可知，牡蠣活性肽對卵巢癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，為了證實牡蠣活性肽對腫瘤細胞的運動和侵襲能力不是由于其毒性所導致，因此選取無細胞毒性的質量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽進行實驗，且證實該質量濃度下的牡蠣活性肽能夠有效抑制卵巢癌細胞Transwell小室侵襲能力和細胞遷移能力，推測牡蠣活性肽可能是卵巢癌淋巴轉移的潛在抑制劑。本研究以具有淋巴結定向高轉移潛能的癌細胞株為基礎，探討新型牡蠣活性肽影響腫瘤細胞侵襲轉移能力的抑制作用，為研發新型抗腫瘤轉移的小分子保健食品提供一條新的途徑。但是腫瘤的侵襲轉移過程是一個多步驟、多因素參與的復雜過程，牡蠣活性肽抗腫瘤侵襲轉移的作用機制有待進一步探索。

參考文獻：

［1］ JEMAL A， TIWARI RC， MURRAY T， et al.Cancer statistics，2004［J］.CA: A Cancer Journal for Clinicians， 2004， 54（1）: 8-29.DOI:10.3322/canjclin.54.1.8.

［2］ 樂杰.婦產科學［M］.7版.北京: 人民衛生出版社， 2008: 278.

［3］ 周璟， 黃學惠.卵巢癌的治療現狀回顧［J］.現代腫瘤醫學， 2012，20（6）: 1308-1311.DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2012.06.73.

［4］ 蔡福龍， 邵宗澤.海洋生物活性物質: 潛力與開發［M］.北京: 化學工業出版社， 2014: 7.

［5］ 陳艷輝， 李超柱， 黎丹戎， 等.動物蛋白酶解制備廣西產牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實驗研究［J］.食品工業科技， 2010， 31（8）: 167-169.

［6］ 李超柱， 陳艷華， 陳艷輝， 等.牡蠣活性肽的分離及其免疫抑制作用的實驗研究［J］.海洋科學， 2013， 37（4）: 52-54.

［7］ 阮和云， 黎丹戎， 李力， 等.卵巢上皮性癌淋巴道定向高轉移細胞系的建立及其生物學特性的鑒定［J］.中華婦產科雜志， 2007， 42（7）: 482-486.DOI:10.3760/j.issn:0529-567x.2007.07.013.

［8］ 顏克蘭， 唐東平， 張傳珉， 等.腫瘤藥敏試驗與臨床病理及療效的關系［J］.中國癌癥防治雜志， 2011， 3（1）: 23-27.DOI:10.3969/ j.issn.1674-5671.2011.01.07.

［9］ 余杰， 楊振國， 陳美珍， 等.牡蠣活性肽體外誘導HeLa細胞凋亡及其作用機制［J］.食品科學， 2012， 33（21）: 290-294.

［10］ 廖共山， 周先果， 班建東， 等.牡蠣活性肽對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖和凋亡的影響［J］.山東醫學， 2009， 49（47）: 13-15.DOI:10.3969/ j.issn.1002-266X.2009.47.005.

［11］ 梁盈， 黃大川， 石松林， 等.牡蠣低分子活性肽對人肺腺癌A549細胞形態與超微結構變化的影響［J］.廈門大學學報（自然科學版）， 2006，45（增刊1）: 177-180.DOI:10.3321/j.issn:0438-0479.2006.z1.044.

［12］ 李鵬， 李祺福， 石松林， 等.牡蠣天然活性肽對人胃腺癌BGC-823細胞周期與基因表達的調控［J］.中國海洋藥物， 2007， 26（3）: 1-8.DOI:10.3969/j.issn.1002-3461.2007.03.001.

［13］ FRIEDL P， WOLF K.Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms［J］.Nature Reviews Cancer， 2003， 3（5）: 362-374.DOI:10.1038/nrc1075.

［14］ 高衛棟， 王紅兵， 吳澤志， 等.腫瘤細胞遷移特性及細胞遷移能力表征［J］.細胞生物學雜志， 2008， 30（4）: 451-456.DOI:10.3969/ j.issn.1674-7666.2008.04.008.

［15］ 李南， 韋興， 陳秉耀， 等.類間充質干細胞成瘤過程中運動及遷移能力的變化［J］.中國骨腫瘤骨病， 2010， 9（4）: 342-345.DOI:10.3969/ j.issn.1671-1971.2010.04.017.

［16］ 饒毅， 吳瑛.神經細胞遷移導向的分子機制［J］.生理科學進展， 2000，31（3）: 198-204.

［17］ 唐杰， 陳龍菊， 王軍， 等.Transwell和Wound healing在細胞遷移中的應用比較［J］.中國臨床解剖學雜志， 2008， 25（6）: 687-689.DOI:10.3969/j.issn.1001-165X.2007.06.022.

［18］ 劉小慧， 章濤， 張潛， 等.兔動員外周血間充質干細胞集落形成能力與神經元誘導分化研究［J］.西安交通大學學報（醫學版）， 2014，35（1）: 26-29.DOI:10.7652/jdyxb201401006.

［19］ 師忠芳， 韓明， 徐立新， 等.體外培養大鼠星形膠質細胞劃傷模型［J］.中國康復理論與實踐， 2007， 13（12）: 1132-1133.DOI:10.3969/ j.issn.1006-9771.2007.12.014.

［20］ 蔣海鷹， 顏亞暉， 羅庚求， 等.細胞體外侵襲實驗中Transwell plate染色技術改良［J］.中國組織化學與細胞化學雜志， 2011， 20（6）: 644-645.DOI:10.3870/zgzzhx.2011.06.022.

［21］ 紀曉寧， 豐有吉.上皮性卵巢癌病因學研究進展［J］.中國癌癥雜志，2014， 24（11）: 861-864.DOI:10.3969/j.issn.1674-1870.2010.05.008.

［22］ 朱根海， 楊舒盈， 陳春英， 等.卵巢癌轉移灶細胞粘附分子檢測及其腹腔播散機制探討［J］.中國優生與遺傳雜志， 2000， 8（3）: 31-32.DOI:10.3969/j.issn.1006-9534.2000.03.013.

［23］ 田紅， 于鵬， 吳小茗， 等.卵巢癌的治療藥物研究進展［J］.現代藥物與臨床， 2015（1）: 103-107.DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2015.01.023.

［24］ 柴周芳， 翟東霞， 俞超芹.卵巢癌靶向藥物治療的研究進展［J］.中國婦產科臨床雜志， 2014（5）: 471-472.

［25］ 劉云， 杜成， 劉文超.卵巢癌治療新進展［J］.現代腫瘤醫學， 2015，23（4）: 553-556.DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2015.04.36.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613036

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0199-05

收稿日期：2015-08-02

基金項目：廣西自然科學基金面上項目（2014GXNSFAA118066）

作者簡介：李超柱（1957—），男，教授，學士，研究方向為天然產物有機化學。E-mail：lcz1657@163.com

*通信作者：黎丹戎（1963—），女，教授，學士，研究方向為天然產物抗腫瘤活性分子篩選與作用機制。E-mail：danrongli@163.com

Bioactive Peptide Derived from Oyster Meat from Guangxi Region， China Inhibits Proliferation and Migration of Human Ovarian Carcinoma Cells with Directional High Lymphatic Metastasis

LI Chaozhu1， CHEN Yanhui1， CHEN Yanhua2， LI Danrong3，*
（1.Qinzhou University， Qinzhou 535000， China； 2.Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Nanning 530021， China；3.Institute of Life Science， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

Abstract:Objective: To study the inhibitory effect of bioactive peptide derived from oyster meat Guangxi region，China on the proliferation and migration of human ovarian carcinoma cells with directional high lymphatic metastasis （SKOV3-PM4 cells）. Methods: The 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide （MTT） assay was performed to study the inhibitory effect of the bioactive peptide on cell proliferation in 24 h. The proliferative ability of SKOV3-PM4 cells was detected by cell counting method and colony formation test.The ability of cell migration and invasion was examined by cell wound scratch assay and matrigel invasion assay.Results: MTT results showed that the bioactive peptide could inhibit the proliferation of SKOV3-PM4 within the concentration range of 5-80 mg/L and that half inhibition concentration （IC50） in 24 hours was 35.36 mg/L.The cell growth curve and cell colony formation showed that the proliferative ability of SKOV3-PM4 cells was significantly inhibited （P < 0.05）.Compared with control cells， after being treated with 4 mg/L （non-cytotoxic concentration） the bioactive peptide， the migration and invasion capability of SKOV3-PM4 was also significantly decreased （P < 0.05）.Conclusion: The bioactive peptide derived from oyster from Guangxi region can inhibit the proliferation and migration of SKOV3-PM4 cells within a certain concentration range.

Key words:bioactive peptide derived from oyster； ovarian cancer； lymphatic metastasis； cell migration