番茄紅素在大鼠肝臟中的幾何異構體組成

惠伯棣，馮潤月，宮 平（北京聯合大學應用文理學院食品科學系，北京 100191）

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番茄紅素在大鼠肝臟中的幾何異構體組成

惠伯棣，馮潤月，宮 平
（北京聯合大學應用文理學院食品科學系，北京 100191）

摘 要：目的：測定大鼠肝臟組織中番茄紅素的含量及番茄紅素幾何異構體（順/反異構體）的組成，為番茄紅素在體內的代謝及生物學功能研究提供參考。方法：選用大鼠為動物模型，用番茄提取物配制灌胃液。一次灌胃8 h后取大鼠肝臟組織，提取其中的番茄紅素。應用C30-高效液相色譜-光電二極管陣列（C30-high performance liquid chromatography-photodiode array detection，C30-HPLC-PDA）法測定提取物中番茄紅素的總量和幾何異構體組成。結果：大鼠肝臟中總番茄紅素含量為92.95 μg/g（以鮮質量計）。與灌胃液中的番茄紅素幾何異構體組成比較，大鼠肝臟組織中存在更多數量和種類的順式異構體，包括13Z-番茄紅素、11Z-番茄紅素、9Z-番茄紅素和5Z-番茄紅素異構體。結論：這一現象對研究番茄紅素在肝臟內的貯存、靶向調動和生物學功能具有重要意義。

關鍵詞：番茄紅素；幾何異構體；肝臟；代謝

引文格式：

惠伯棣， 馮潤月， 宮平.番茄紅素在大鼠肝臟中的幾何異構體組成［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 189-193.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613034. http://www.spkx.net.cn

HUI Bodi， FENG Runyue， GONG Ping.Geometric isomer composition of lycopene from rat liver［J］.Food Science， 2016，37（13）: 189-193.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613034. http://www.spkx.net.cn

番茄紅素（l y c o p e n e）是一種類胡蘿卜素（carotenoid），由碳氫元素組成。其半系統命名為ψ-胡蘿卜素，分子式為C40H56。番茄紅素分子由中央多聚烯鏈和開環末端基團構成。由于其具有高度不飽和性，番茄紅素在理論上可形成多種幾何異構體。在自然界中番茄紅素通常以全反式異構體（all E-isomer）的形式存在。其分子結構見圖1。

在自然界中，番茄紅素同時還存在著少量順式異構體（Z-isomer）。最常見的有13Z-番茄紅素、9Z-番茄紅素和5Z-番茄紅素這3 種單順式異構體［1］。由于其分子空間結構不同，番茄紅素各異構體的生物學功能也有所不同。根據文獻報道，在體外抗氧化實驗中，全反式異構體的抗氧化性明顯優于順式異構體。但由于順式異構體在體內溶解性好，生物利用度高，故其在體內的抗氧化性反而高于全反式異構體［2］。

番茄紅素具有預防與治療多種疾病的功能。這方面的研究成果及報道在近年來迅速增多，如防治前列腺增生及癌癥［3］、體內抗氧化［4］、抗消化道癌變［5］、降低肺癌風險［6］、抗糖尿病［7］、控制體質量［8］等。因此番茄紅素也被越來越多地考慮應用在功能性食品中［9］，從而進一步推動了對番茄紅素在體內吸收、轉運和代謝的研究，但目前其相關報道十分有限。已有的研究報道結果可概括為：被人體攝入的番茄紅素經小腸吸收進入血清，然后被轉運到靶器官。其中一部分轉運到肝臟中貯存。當靶器官需要時，再從肝臟調出，再經血清轉運至靶器官參與代謝反應［10］（圖2）。肝臟在這一過程中被認為執行了“庫”的功能。因此，研究肝臟中番茄紅素的存在形式對探討其在體內的轉運和在靶器官中發生代謝反應的機制具有重要意義。

本課題組已經報道了一次口服番茄紅素后雄性大鼠肝臟中番茄紅素的積累情況［11］和應用C30-高效液相色譜-光電二極管陣列（C30-high performance liquid chromatographyphoto-diode array detection，C30-HPLC-PDA）分離和檢測番茄紅素幾何異構體的方法［12-15］。本研究擬繼續采用這一方法對大鼠肝臟中的番茄紅素幾何異構體組成進行檢測，希望研究結果對揭示番茄紅素在體內的轉運和代謝機理有一定幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

番茄萃取物由新疆紅帆生物科技有限公司提供，該產品為番茄果皮的超臨界CO2流體萃取物。其總類胡蘿卜素含量為6%，其中番茄紅素占94.74%，β-胡蘿卜素占5.26%（以上均為質量分數）。

番茄紅素參比樣品（商品號：L9879）購自美國Sigma公司，番茄紅素含量為90%～95%。先用本研究所采用的色譜條件檢測了其番茄紅素幾何異構體組成。其全反式異構體的比例大于99%。故使用前未經進一步純化。

萃取用正己烷、甲醇、石油醚（沸點：60～90 ℃）為分析純 北京化工廠；色譜用流動相乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）為色譜純美國迪馬公司。

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量（350±5） g，購自北京大學醫學部實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（京）2006-0008。

1.2 儀器與設備

Multispec-1501型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Waters 1525 HPLC系統（配有PDA-2996檢測器） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃劑量的選擇

大鼠的番茄紅素灌胃劑量參照惠伯棣等［16］在番茄紅素血清動力學研究中的劑量，為每次5.25 mg/只，折合標準體質量（50 kg）人體攝入量為每次150 mg/人。

1.3.2 灌胃液的配制

稱取一定量的番茄萃取物完全溶于正己烷中，再混溶于100 mL豆油中。45 ℃、－0.06 MPa、避光條件下在旋轉蒸發儀上將正己烷完全蒸出。用石油醚定量稀釋油溶液。采用紫外-可見光分光光度計在475 nm波長處比色測定吸光度，根據下式計算油溶液中番茄紅素的質量，使配制成的番茄紅素油溶液終質量濃度為5.25 mg/mL，室溫避光保存。

式中：m為樣品中番茄紅素的質量/g；V為樣品溶液的體積/mL；A475 nm為樣品的吸光度；ε為吸光系數，定義為在1 cm光程長的比色杯中1 g/100 mL溶質的理論吸收值，在此ε=3 450［17-18］。

操作注意事項：在蒸發正己烷期間應注意嚴格避光，以避免在加熱的狀態下油溶液中大量全反式番茄紅素發生幾何異構化；灌胃液的配制應遵循隨用隨配的原則，不建議將其放在冰箱中貯存，原因是在4 ℃條件下番茄紅素在油溶液中已形成顆粒結晶，導致灌胃液不均勻和生物利用度下降。

1.3.3 實驗動物灌胃與肝臟收集

雄性SD大鼠在動物房中用標準飼料飼養3 d后隨機分為兩組：第1組6 只，第2組3 只。第1組每只大鼠灌胃1 mL灌胃液，第2組每只大鼠灌胃1 mL豆油。根據惠伯棣等［16］的報道：攝入番茄紅素12 h后，大鼠血清中番茄紅素水平下降到最低檢測限。又根據惠伯棣等［11］的報道，攝入番茄紅素8 h后，雄性大鼠肝臟中番茄紅素積累水平達到最高值。因此，在本實驗中，灌胃8 h后采用股動脈放血法處死大鼠，取肝臟。第1組大鼠的平均肝質量為（11.72±0.74）g，第2組大鼠的平均肝質量為（11.81±0.24）g。

1.3.4 番茄紅素的萃取與濃縮

大鼠肝臟中總類胡蘿卜素萃取方法參照Khachik等［19］的方法并作適當優化以使番茄紅素的萃取率提高，降解率降低：將大鼠肝臟用組織勻漿器進行破碎后，取4 g肝臟勻漿液加入2 mL甲醇（－20 ℃），振蕩30 s，沉淀蛋白。向帶有蛋白沉淀的懸濁液中加入3 mL正己烷，振蕩10 min。4 600 r/min離心10 min，取上清液2.6 mL，用N2吹干至1 mL。全程避光，并于冰浴中操作。按上述方法萃取每只大鼠肝臟中的類胡蘿卜素，10 000 r/min離心3 min。取上清液進樣用于HPLC分析。

1.3.5 大鼠肝臟萃取物的C30-HPLC-PDA分析

用于本研究的C30-HPLC-PDA設備具有良好的穩定性和重現性（相對標準偏差＜7%）。HPLC條件已由丁靖等［20］報道，并優化如下：色譜柱：YMC Carotenoid S-5 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流動相B：MTBE；流動相A與B中分別加入體積分數為0.05%的三乙胺；線性梯度洗脫：B液在8 min內由體積分數0%增加至55%；8～40 min內B液維持在55%；流速：1.0 mL/min；檢測波長：475 nm；PDA光譜收集范圍：260～600 nm；進樣量：20 μL。對各組分積分得峰面積。

1.3.6 灌胃液的C30-HPLC-PDA分析

取0.5 mL灌胃液，用正己烷定容至50 mL。取1 mL定容液，10 000 r/min離心3 min，取上清液進樣。色譜條件同1.3.5節。

1.3.7 標準曲線的繪制

稱取番茄紅素參比樣品1 mg（精確至0.000 1 g），加入1 mL二氯甲烷使其完全溶解，轉移至25 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容至25 mL，配制成40 μg/mL的儲備液，保存于－20 ℃冰箱中。使用前用石油醚稀釋為6 個不同質量濃度的工作液。取工作液分別進樣，以C30-HPLC測定全反式番茄紅素組分含量與其色譜峰面積的關系，得到質量濃度（x，μg/mL）-峰面積（y，μV·s）線性回歸方程：y=296x（R2=0.996 0）。

1.3.8 各番茄紅素幾何異構體組分的定性與定量分析

根據組分的色譜行為和光譜特征對番茄紅素幾何異構體進行鑒定。根據各組分在HPLC圖上的峰面積以及標準曲線回歸方程計算各組分的質量濃度。

根據李京等［21］的報道，雖然番茄紅素順式異構體的吸光系數與全反式異構體不同，但這一結果尚未經其他研究團隊證實。因此，在本研究中依舊根據番茄紅素全反式異構體的吸光系數計算順式異構體的含量。

2 結果與分析

2.1 灌胃液中類胡蘿卜素組分的分離結果

本實驗所用番茄紅素萃取物為番茄果皮的超臨界CO2萃取物，該萃取物中所含主要類胡蘿卜素為番茄紅素，此外，還含有少量的β-胡蘿卜素。其中除全反式番茄紅素外，還含有少量的順式番茄紅素。圖3為番茄紅素萃取物的C30-HPLC-PDA圖。組分Ⅰ的保留時間與番茄紅素全反式異構體參比樣品的保留時間一致。

2.2 大鼠肝臟萃取物中類胡蘿卜素組分的分離結果

圖4為灌胃8 h后大鼠肝臟萃取物的C30-HPLC-PDA圖。組分Ⅰ的保留時間與番茄紅素全反式異構體參比樣品的保留時間一致。

2.3 各組分電子吸收光譜特征比較

使用HPLC系統上配備的PDA檢測器，可在線采集各組分的電子吸收光譜。圖5為組分Ⅰ～Ⅴ的電子吸收光譜，各組分電子吸收光譜特征分析結果見表1。5 個組分的主吸收帶最大吸收波長發生了7 nm的變化，而順式峰最大吸收波長（362 nm）未見明顯變化。

注：順式峰相對強度=順式峰強度/主峰強度；—.Ⅵ無順式峰。

2.4 灌胃液與大鼠肝臟提取物中番茄紅素幾何異構體的定性分析

根據各組分的色譜行為和光譜特征對各組分定性，認為組分Ⅰ～Ⅵ分別為全反式-番茄紅素、5Z-番茄紅素、9Z-番茄紅素、11Z-番茄紅素、13Z-番茄紅素和β-胡蘿卜素，其中除了組分Ⅳ未得到質譜數據支持，其他均可由文獻［13］支持。圖6為4 種番茄紅素順式異構體的分子結構。

2.5 灌胃液與大鼠肝臟提取物中番茄紅素幾何異構體的定量分析

注：組分相對含量/%=（組分峰面積/總峰面積）×100。

由表2可知，在灌胃液中番茄紅素的主要存在形式為全反式異構體，此外還含有少量的11Z-番茄紅素異構體，其他種類異構體比例極低。與灌胃液相比，大鼠肝臟中含有大量的番茄紅素順式異構體，包括13Z-番茄紅素、11Z-番茄紅素、9Z-番茄紅素、5Z-番茄紅素異構體。換言之，從大鼠肝臟中檢測出的番茄紅素組分中，順式異構體比例明顯上升，總順式異構體比例超過60%，同時全反式番茄紅素比例下降。

3 討 論

本研究發現，全反式番茄紅素在大鼠肝臟中以大量順式異構體形態存在，這一現象在國內外文獻中尚未見報道。這一現象的發現可能對番茄紅素生物學功能和其在體內的代謝研究產生重要影響。根據惠伯棣等［16］的報道，番茄紅素在血液中的存在形式就包括大量順式異構體。因此，來自消化道的全反式異構體發生順式異構化應該不是發生在肝臟中。

此外，由于不同異構體在體內的溶解性和抗氧化能力均有所不同［22］，可以設想在肝臟內中存在的順式異構體具有不同于全反式異構體的生物學功能。當體內靶器官需要調動貯存在肝臟內的番茄紅素時，肝臟中的各種幾何異構體以何種形態和數量再度進入血液是非常值得探討的問題。本研究結果將有助于推動番茄紅素在體內代謝和生物功能研究的進一步發展。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613034

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0189-05

收稿日期：2015-07-24

基金項目：北京市教委科技發展計劃重點項目（KZ20051147020）

作者簡介：惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn

Geometric Isomer Composition of Lycopene from Rat Liver

HUI Bodi， FENG Runyue， GONG Ping
（Department of Food Science， College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing 100191， China）

Abstract:Total lycopene amount and lycopene geometric isomer composition of rat liver were determined in this study，aiming to lay a foundation for in vivo studies on lycopene metabolism and biological function.In the experiment， male rats were administrated with tomato extract at a single dose.After 8 h， liver tissues were collected for the extraction of lycopene.The total amount and geometric isomer composition of lycopene were determined by C30-high performance liquid chromatography with photodiode array detection （C30-HPLC-PDA）.Results indicated that total amount of lycopene from liver tissues was 92.95 μg/g fresh weight.In comparison with tomato extract， the composition and amount of lycopene Z-isomers （including 13Z-， 11Z-， 9Z- and 5Z-isomer） were increased in rat liver tissues.This phenomenon is important for investigating the storage， targeting transfer and biological function of lycopene in liver.

Key words:lycopene； geometric isomer； liver； metabolism