水解小麥蛋白肽對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷的保護作用

楊 賢，王炎炎，王 鋒，夏 惠，潘興昌，朱航櫸，谷瑞增，馬永慶，唐華麗，王少康，孫桂菊，*（.東南大學公共衛生學院 環境醫學工程教育部重點實驗室/營養與食品衛生學系，江蘇 南京 0009；.中國食品發酵工業研究院，北京 0008）

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水解小麥蛋白肽對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷的保護作用

楊 賢1，王炎炎1，王 鋒1，夏 惠1，潘興昌2，*，朱航櫸1，谷瑞增2，馬永慶2，唐華麗1，王少康1，孫桂菊1，*
（1.東南大學公共衛生學院 環境醫學工程教育部重點實驗室/營養與食品衛生學系，江蘇 南京 210009；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100028）

摘 要：目的：研究水解小麥蛋白肽對大鼠急性酒精性損傷模型胃黏膜損傷的保護作用。方法：將60 只Wistar大鼠隨機分成空白對照組、胃黏膜損傷模型對照組、水解小麥蛋白肽低、中、高劑量組（劑量分別為167、333、667 mg/（kg·d）（以體質量計，下同））、陽性對照組（甲氰咪胍組65 mg/（kg·d）），每組各10 只。采用酒精灌胃致胃黏膜損傷，給予水解小麥蛋白肽30 d后，觀察胃黏膜組織的大體變化和病理組織學改變，測定大鼠血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）、血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、前列腺素E2（prostaglandin E-2，PGE2）、白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，大鼠胃組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達水平。結果：水解小麥蛋白肽能明顯改善胃黏膜組織損傷，降低損傷積分（P＜0.05），提高損傷抑制率；各劑量組均能提高大鼠血清PGE2含量、EGF含量、SOD活力及胃組織EGFR表達水平，降低大鼠血清MDA含量、IL-8含量及胃組織Caspase 3表達水平（P＜0.05），低、中劑量組能降低血清PAF含量（P＜0.05）。結論：水解小麥蛋白肽對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷具有一定保護作用，其機制可能與增強胃黏膜保護因子、提高抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用有關。

關鍵詞：水解小麥蛋白肽；胃黏膜損傷；酒精

引文格式：

楊賢， 王炎炎， 王鋒， 等.水解小麥蛋白肽對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷的保護作用［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 178-182.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613032. http://www.spkx.net.cn

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胃潰瘍是我國的常見病、多發病之一［1］。胃黏膜損傷是胃潰瘍發生的早期病變反應，經口攝入高濃度乙醇出現胃黏膜充血、水腫、出血、糜爛及潰瘍形成等癥狀［2］。水解小麥蛋白肽是一類來源于小麥蛋白水解產物的生物活性肽，具有豐富的生物學功能，如阿片活性［3］、抑癌活性［4］、抑制血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）活性［5］、抗氧化［6］等。本實驗前期結果表明小麥活性肽能顯著提高機體對食物蛋白質的消化與利用、促進胃腸道上皮的生長、減輕非甾體類藥物對胃腸道的損傷、有一定的胃腸道保護作用，且目前小麥活性肽的制備、鑒定技術相對比較成熟［7］，擬通過以下實驗研究水解小麥蛋白肽粉對大鼠酒精性胃黏膜損傷的保護作用并探討其作用機制，為小麥活性肽作為功能性食品的開發積累一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級Wistar大鼠70 只，雄性，體質量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2012-0001）；標準鼠糧，購于南京市江寧區青龍山實驗動物繁殖場；大鼠飼養于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物房（實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2013-0037）。

水解小麥蛋白肽粉（3 374.5 D），由中國食品發酵工業研究院提供；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）、前列腺素E2（prostaglandin E-2，PGE2）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）試劑盒 上海基爾頓生物科技有限公司；Caspase-3 艾美捷科技有限公司；表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）成都正能生物技術責任有限公司；DAB顯色試劑盒（20×）、KIT-9921即用型免疫組化試劑盒（鼠/兔）福州邁新試劑生物技術開發有限公司。

1.2 儀器與設備

722N型可見光分光光度計 上海精密儀器有限公司；VERSAmax酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及樣品采集

70 只Wistar大鼠隨機取樣10 只進行酒精預實驗造模，禁食不禁水24 h，給予無水乙醇1.0 mL/只，1 h后處死動物，取材觀察，以確定模型是否成立。

造模成功后，將剩余大鼠隨機分成6 組，分別是空白對照組、胃黏膜損傷模型對照組、低劑量水解小麥蛋白肽粉組（167 mg/（kg·d））、中劑量水解小麥蛋白肽粉組（333 mg/（kg·d））、高劑量水解小麥蛋白肽粉組（667 mg/（kg·d））和甲氰咪胍組（65 mg/（kg·d））。低、中、高水解小麥蛋白肽粉劑量組大鼠每天用1 mL含不同劑量的水解小麥蛋白肽粉溶液灌胃，空白對照組和胃黏膜損傷對照組大鼠每天按等體積蒸餾水灌胃，連續灌胃30 d。

灌胃30 d后，全部大鼠嚴格禁食24 h（不禁水），此期間亦禁止給予水解小麥蛋白肽。除空白對照組外，所有實驗組動物給予無水乙醇1.0 mL/只，1 h后股動脈采血，采集血清樣品，－20 ℃保存備用；然后處死動物，暴露完整胃，結扎幽門，灌注適量10%的甲醛溶液，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物，展開胃黏膜。

1.3.2 大體觀察及評分

用游標卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度。因寬度所代表的損傷程度遠大于長度，故雙倍積分，評分標準見表1。

注：胃黏膜上出血點的個數即為得分。

各實驗組胃黏膜損傷程度以損傷發生率、損傷積分指數和損傷抑制率表示。各指標計算公式如下。

式中：A、B分別為模型組與實驗組的損傷積分指數。

大體觀察評分完畢，將每只動物胃黏膜損傷最嚴重的部位，切下約10 mm×2 mm 的組織塊，固定于10%甲醛溶液，常規制片，蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，鏡下觀察。注意選擇胃黏膜正橫切面，包括黏膜全層的區域觀察。評分方法：以充血、出血、黏膜細胞變性壞死占整個黏膜上皮層的比例分為5 級。充血權重為1，出血權重為2，上皮細胞變性壞死權重為3，評分標準見表2。按下式計算病變總積分公式。

表 2 急性胃黏膜損傷病理觀察評分標準Table 2 Scoring criteria for ethanol-induced gastric mucosal damageundermicroscope病變癥狀 1 分 2 分 3 分 4 分 5 分充血 ＜1/5 1/5～2/5 2/5～3/5 3/5～4/5上皮全層出血 ＜1/5 1/5～2/5 2/5～3/5 3/5～4/5上皮全層上皮細胞變性壞死 ＜1/5 1/5～2/5 2/5～3/5 3/5～4/5上皮全層

1.3.3 生化指標的測定

按照試劑盒說明測定大鼠血清中的SOD活性、MDA含量、PAF含量、EGF含量、IL-8含量和PGE2含量。免疫組化法測定大鼠胃組織中Caspase 3、EGFR表達水平。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 胃黏膜的組織病理學變化

如圖1可知，無水乙醇導致的胃黏膜損傷，主要病變癥狀為胃黏膜上皮細胞變性、壞死，伴有局部出血和充血。水解小麥蛋白肽的低劑量對胃黏膜損傷有抑制作用，胃黏膜的損傷比較輕微，然而隨劑量增加對損傷的抑制作用并未繼續增強。通過表3可以得出，灌胃水解小麥蛋白肽有減輕胃黏膜損傷作用，低、中、高劑量水解小麥蛋白肽組與模型組相比均有顯著差異（P＜0.05）。

注：*.與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05）；#.與胃黏膜模型損傷對照組相比差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 大鼠血清中氧化應激標志物MDA含量的變化

表 4 大鼠血清中MDA含量及SOD活性的變化（x±s，n=10）Table 4 Effect of HWP onMDA level and SOD activity in serum （x± s， n=10）組別 MDA含量/（nmol/L） SOD活力/（U/L）空白對照組 2.61±0.68 110±8胃黏膜損傷模型對照組 6.48±0.79* 129±11*甲氰咪胍組 4.58±0.44#146±15#低劑量水解小麥蛋白肽組 3.50±0.44#193±21#中劑量水解小麥蛋白肽組 3.88±0.65#169±20#高劑量水解小麥蛋白肽組 4.41±0.40#163±16#

由表4可知，灌胃水解小麥蛋白肽30 d后，無水乙醇致大鼠胃黏膜損傷，采集大鼠血清樣品，發現與空白組相比，損傷組大鼠血清中MDA含量顯著增加（P＜0.05），表明大鼠體內氧化應激程度加劇。而灌胃低、中、高劑量的水解小麥蛋白肽，均能顯著減少酒精損傷導致的血清中的氧化應激（P＜0.05）。

2.3 大鼠血清中抗氧化應激酶活力的變化

當機體的氧化應激程度加劇時，機體主要通過上調抗氧化應激酶的活力來降低機體的氧化應激程度。由表4可知，酒精致大鼠胃黏膜損傷后，大鼠機體的氧化應激程度加劇，同時血清中的SOD的活力顯著的代償性升高（P＜0.05），而灌胃低、中、高劑量的水解小麥蛋白肽，均能顯著提高血清中SOD的活力（P＜0.05），減少急性酒精性胃黏膜損傷后大鼠機體的氧化應激程度，有一定的抗氧化保護作用。

2.4 大鼠血清中PAF、PGE2、EGF及IL-8含量的變化

表 5 大鼠血清中PGE2、EGF、PAF及IL-8含量的變化（x±s，n=10）Table 5 Effect of HWP on PGE2， EGF， PAF and IL-8 levels in serum （x±s，n= 10）組別 PGE2含量/ （ng/L）EGF含量/ （ng/L）PAF含量/ （μg/L）IL-8含量/ （pg/mL）空白對照組 554±39 5 968±497 7.42±1.02 73±12胃黏膜損傷模型對照組 239±32* 2 281±311*18.18±1.07* 188±15*甲氰咪胍組 374±25#3 553±431#15.64±1.18#143±20#低劑量水解小麥蛋白肽組 452±44#4 102±557#11.65±1.09#105±13#中劑量水解小麥蛋白肽組 415±60#3 934±321#14.27±2.04#118±18#高劑量水解小麥蛋白肽組 321±52#3 404±346#17.48±0.84 138±17#

由表5可知，與空白對照組相比，胃黏膜損傷模型對照組的血清中PAF及IL-8的含量顯著增加（P＜0.05），PGE2、EGF的含量顯著降低（P＜0.05）。灌胃低、中、高劑量水解小麥蛋白肽，能顯著提高大鼠血清中PGE2、EGF的含量，降低大鼠血清中IL-8的含量（P＜0.05）。而灌胃低、中劑量水解小麥蛋白肽，能顯著降低大鼠血清中PAF的含量（P＜0.05）。

2.5 胃組織中Caspase 3及EGFR表達水平的變化

表 6 大鼠胃體組織中Caspase3和EGFR表達水平的變化（x±s，n=10）Table 6 Effect of HWP oncaspase3 andEGFRexpression in stomach （x±s，n= 10）組別 Caspase 3表達量 EGFR表達量空白對照組 0.40±0.55 0.40±0.55胃黏膜損傷模型對照組 10.20±0.84* 4.20±0.84*甲氰咪胍組 3.60±0.55#9.80±0.84#低劑量水解小麥蛋白肽組 4.60±0.89#9.40±1.14#中劑量水解小麥蛋白肽組 7.40±0.55#7.60±0.89#高劑量水解小麥蛋白肽組 9.00±0.71#6.40±0.55#

由表6可知，與空白對照組相比，胃黏膜損傷模型對照組的胃組織中Caspase 3的表達水平顯著升高（P＜0.05），EGFR的表達水平顯著降低（P＜0.05）。灌胃低、中、高劑量的水解小麥蛋白肽能顯著降低大鼠胃組織中Caspase 3的表達水平（P＜0.05），顯著提高大鼠胃體組織中EGFR的表達水平（P＜0.05）。

3 討 論

乙醇是常見的致胃黏膜損傷因子，對胃黏膜具有腐蝕性，能夠破壞表面黏液層及黏液細胞并削弱胃黏膜防御因子的保護作用［9］，大鼠灌胃1 mL無水乙醇后，病理組織切片觀察，可見明顯的胃黏膜上皮細胞變性、壞死，并伴有局部出血和充血，脂質過氧化程度加劇，細胞凋亡明顯增加。

本研究結果表明灌胃不同劑量水解小麥蛋白肽能夠顯著降低乙醇誘導的大鼠胃黏膜出血損傷，具體表現為大體觀察與病理組織損傷積分顯著降低，損傷抑制率增加。MDA是脂質過氧化反應中產生的過氧化物，其含量的變化反映了機體組織細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是機體清除氧自由基的重要酶，可通過歧化反應清除機體內氧代謝過程中產生的有害超氧負離子自由基，從而達到解毒的目的，它的活性狀態對維護黏膜完整性具有重要的影響［10-11］。本實驗結果顯示水解小麥蛋白肽可以顯著提高大鼠血清SOD的活性，并有效抑制MDA水平的增高，表明水解小麥蛋白肽能提高機體抗氧化并清除自由基能力，降低脂質過氧化能力。

PAF是目前發現的促潰瘍遞質中最強的一種，它可以導致血管收縮，通透性升高，微循環障礙及炎癥反應，最終引起胃黏膜損傷，甚至潰瘍的形成［12-13］，灌胃低、中劑量水解小麥蛋白肽能顯著降低血清中PAF的含量。PGE2是胃黏膜重要的調控介質，在組織中的減少與多種因素導致的胃黏膜損傷有關［14-15］，PGE2可改善胃黏膜血流量，清除對上皮屏障具有損傷作用的物質，對胃黏膜的完整起到重要的保護作用［16-18］。EGF是一種作用廣泛的胃腸道營養多肽，是調節潰瘍愈合的重要中介因子，能夠降低胃黏膜損傷程度，促進組織損傷修復，促使潰瘍愈合的作用［1，19-20］。EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的細胞表面受體，其與相應配體結合后，通過自身磷酸化而參與細胞的信號轉導，經過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯反應，調節轉錄因子激活mRNA的轉錄，指導細胞遷移、黏附、增殖、分化、凋亡［21］，潰瘍胃黏膜中EGF和EGFR的基因表達上調，可刺激上皮細胞增殖和遷移，加速上皮更新和修復過程［22-23］。灌胃水解小麥蛋白肽能顯著提高PGE2及EGF的含量及胃組織中EGFR的表達水平，降低胃黏膜損傷程度，加速胃黏膜的修復。IL-8是目前已知最強的多形核白細胞趨化和激活因子，它可誘導多形核白細胞形態變化、趨化，使細胞內Ca2+濃度短暫性升高，促進多形核白細胞脫顆粒，溶酶體酶釋放，黏附蛋白上調，生物活性脂質形成和呼吸爆發，形成超氧化物［24］，從而促進炎癥反應的發生。IL-8主要生物學效應是趨化中性粒細胞向炎癥部位聚集，促進其吞噬作用，但亦造成局部組織炎癥和潰瘍加劇［25-26］。灌胃水解小麥蛋白肽能顯著降低大鼠血清IL-8含量，具有一定的抗炎作用。

Caspase 3是Caspase家族中的最重要的凋亡執行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應因子。它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志［27］，應激性胃黏膜損傷后，Caspase 3表達水平顯著增加，加劇細胞凋亡。研究表明細胞凋亡是造成急性胃黏膜損傷的重要因素，并由細胞因子誘導［28-29］。細胞凋亡過度而細胞增殖受抑將破壞黏膜的完整性，并最終導致黏膜損傷［30］。灌胃水解小麥蛋白肽能顯著降低大鼠胃組織中Caspase 3的表達水平，減少了胃黏膜上皮細胞的凋亡，促進了損傷的愈合。

綜上所述，本研究的水解小麥蛋白肽能顯著改善大鼠酒精性胃黏膜損傷的程度，增強胃黏膜保護因子，提高抗氧化及清除自由基能力，降低脂質過氧化能力。本實驗結果也顯示水解小麥蛋白肽可顯著減輕大鼠酒精性胃黏膜損傷的炎癥反應，減少胃黏膜上皮細胞的凋亡，促進胃黏膜損傷的愈合。因此，水解小麥蛋白肽的作用機制可能與增強胃黏膜保護因子，抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用機制有關。

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孫桂菊（1963—），女，教授，博士，研究方向為營養與食品衛生。E-mail：gjsun@seu.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613032

中圖分類號：R151

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0178-05

收稿日期：2016-01-21

基金項目：國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102205-02）；科技北京百名領軍人才培養工程項目（Z131110000513026）

作者簡介：楊賢（1989—），男，碩士研究生，研究方向為營養與食品衛生。E-mail：1105055484@qq.com

*通信作者：潘興昌（1966—），男，副主任醫師，博士，研究方向為食品營養。E-mail：nutripan@163.com

Effect of Hydrolyzed Wheat Protein Peptide on Ethanol-Induced Acute Gastric Mucosal Damage in Rats

YANG Xian1， WANG Yanyan1， WANG Feng1， XIA Hui1， PAN Xingchang2，*， ZHU Hangju1， GU Ruizeng2，MA Yongqing2， TANG Huali1， WANG Shaokang1， SUN Guiju1，*
（1.Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering， Ministry of Education， Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health， Southeast University， Nanjing 210009， China； 2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries， Beijing 100028， China）

Abstract:Objective: The present work was aimed to examine the protective effect of hydrolyzed wheat protein peptide （HWP） in the model rats with acute gastric mucosal damage induced by ethanol.Methods: Hydrolyzed wheat protein peptide （167， 333 or 667 mg/（kg·d） （in body mass）， cimetidine （65 mg/（kg·d））， or distilled water were administered daily by gavage for 30 days before the rats were treated with anhydrous ethanol （1 mL） and then euthanized after 1 h.Histological observation was performed to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory activity of HWP as well as its impact on serum physiological and biochemical parameters and the expression of caspase-3 and epidermal growth factor receptor （EGFR）.Results: Histological observation showed that ethanol-induced gastric mucosal damage was attenuated by hydrolyzed wheat protein peptide pretreatment.Hydrolyzed wheat protein peptide remarkably increased the superoxide dismutase （SOD） activity， epidermal growth factor （EGF） and prostaglandin E-2 （PGE2） levels in serum.Furthermore， it dramatically decreased malondialdehyde （MDA）， platelet-activating factor （PAF） and interleukin-8 （IL-8） levels in serum.The expression level of caspase-3 in stomach was significantly decreased in hydrolyzed wheat protein peptide-treated rats when comparedwith the model group； however， the expression level of EGFR was markedly increased.Conclusion: Ethanol-induced gastric mucosal damage in rats can be protected against by hydrolyzed wheat protein peptide.The potential mechanism may be associated with the enhancement of antioxidant， anti-inflammatory and anti-apoptotic functions.

Key words:hydrolyzed wheat protein peptide； gastric mucosal damage； ethanol