潰瘍性結腸炎患者外周血CD1d(hi) CD5+ CD19+調節性B細胞的變化和臨床意義

劉玲玲，金小晶，楊　勤，崔占清

(江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

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潰瘍性結腸炎患者外周血CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞的變化和臨床意義

劉玲玲，金小晶，楊勤，崔占清

(江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

[摘要]目的檢測潰瘍性結腸炎(UC)患者外周血調節性B細胞含量的變化，探討其在 UC病情活動性與嚴重性評價中的價值。方法采用ELISA法檢測43例活動期UC患者、33例緩解期UC患者及30例健康對照者的外周血調節性B細胞含量，并評價活動期UC患者病情輕重程度，規范治療后復查血調節性B細胞含量。結果活動期UC患者外周血調節性B細胞含量和CRP水平顯著高于緩解期UC患者和正常組(P均<0.05)，緩解期UC患者外周血調節性B細胞含量和CRP水平與正常組比較無明顯升高(P>0.05)；外周血調節性B細胞含量與活動期UC病情活動性、病情輕重程度均呈正相關(r=0.638,0.541，P<0.05)。結論活動期UC患者外周血調節性B細胞含量顯著升高，其可作為病情活動性、嚴重性及療效評價的參考指標。

[關鍵詞]潰瘍性結腸炎；炎癥性腸病；調節性B細胞

潰瘍性結腸炎(UC)是一種非特異性的腸道炎癥性疾病，其確切發病機制尚未明確，可能與環境、遺傳、感染、免疫、精神緊張及過敏等因素有關。目前認為，免疫異常及腸道持續的炎癥損傷是其基本發病機制[1]。B細胞作為機體中一類重要的免疫細胞，在免疫和炎癥反應中行使著多種功能，B細胞不僅可以介導體液免疫和細胞免疫發揮正性免疫調節作用，近年來的研究顯示B細胞中還存在著發揮負性調節作用的細胞亞群[2]。CD1d(hi)CD5+CD19+B細胞是新近報道的一種發揮負性調節作用的細胞，其免疫調節作用已在多種疾病模型中得到證實[3-4]。然而有關這類細胞在UC患者中的研究不多，尤其在疾病過程中其數量比例以及功能的動態變化尚不清楚。本研究檢測UC活動期和緩解期CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞的變化，評價其在UC病情活動性與嚴重性中的臨床意義。

1臨床資料

1.1一般資料選擇本院2014年1—6月住院治療的UC患者76例，其中活動性患者43例，男24例，女19例；年齡30～61(44.6±13.8)歲。緩解期患者33例，男15例，女18例；年齡29～58(40.5±15.2)歲。診斷及臨床分度符合中華醫學會消化病分化炎癥性腸病學科組制定的診斷指南[5]，并均排除近期急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤性疾病、慢性纖維化增生性疾病和播散性血管內凝血，并均未接受任何免疫抑制劑治療。采用Rachmilewitz UC臨床活動指數評估系統(CAI評分)評價病情活動性，>4分為活動性，<4分為緩解期[6]。活動期患者按病情嚴重程度分為輕型、中型、重型。 緩解期患者：3例接受氨基水楊酸制劑治療，30例曾使用過激素和氨基水楊酸制劑聯合治療。選擇健康志愿者30例作為正常組，男17例，女13例；年齡 29～59(42.5±10.5)歲。

1.2方法

1.2.1標本收集用肝素鋰抗凝管抽取早晨時UC患者和健康對照者外周靜脈血自采血完畢后3 h內進行試驗。

1.2.2單個核細胞的提取和培養將2 mL全血和2 mL PBS按1∶1充分混勻后沿管壁緩慢加入3 mL淋巴細胞提取液ficoll離心管中。1 500 r/min水平離心30 min。離心后可見試管內容物可分為4層：第一層為血漿層，第二層為分離液層，單個核細胞層處于血漿層和分離液層中間，底層為紅細胞層。紅細胞層上為粒細胞層；用一次性吸管吸取單個核細胞層收集到另一離心管中；加入6 mL PBS以1 500 r/min，10 min，洗滌2次，棄上清后加RPMI 1640，將細胞數調至2×106個/mL，吸取0.5 mL，加入falcon流式管中，加入刺激劑Golgi(含刀豆蛋白A，脂多糖，離子霉素，葡萄球菌腸毒素B等)2 μL置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.3血清CRP測定血清CRP測定使用德林公司提供的型號為Behring Nephelometer 100分析儀，以散射光比濁法定量測定其濃度。

1.2.4細胞表面和細胞內染色和流式細胞儀測定向falcon管中分別加入10 μL CD5-FITC和CD19-PE充分混勻，室溫避光15 min，加入FIX RERM Reagent(A)100 μL，混勻，室溫避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清加FIX RERM Reagent(B)100 μL，同時向管中加IL-10APC 5 μL混勻,室溫避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清,加500 μL PBS上流式細胞儀檢測。

1.3統計學方法所測數據以均數±標準差表示，應用Spass 18.0醫學統計軟件處理，組間整體比較采用單因素方差分析。2組間數據的比較采用t檢驗，相關分析采用Pearson等級相關法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組CAI評分、CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞及C反應蛋白比較活動期UC患者血CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞水平高于緩解期UC組和正常組(P均<0.05)，與正常組相比，緩解期UC組CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞及C反應蛋白含量升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。活動期UC組CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞數量與CAI評分呈正相關(r=0.568,P<0.05)，與C反應蛋白呈正相關(r=0.532,P<0.01)。見表1。

表1　3組CAI評分、調節性B細胞及CRP比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與緩解期UC組比較，P<0.05。

2.2活動期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞與病情嚴重性的關系活動期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞與病情嚴重性呈正相關(r=0.638,P<0.05),CRP含量與病情嚴重性呈正相關(r=0.541,P<0.05)。輕型活動期UC患者CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞及CRP水平明顯低于中型和重型患者，中型上述指標水平明顯低于重型患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2　活動期UC患者各型調節性B細胞及

注：①與輕型活動期UC組比較，P<0.05；②與重型活動期UC組比較，P<0.05。

3討論

潰瘍性結腸炎是一種主要累及直腸的非特異性炎性疾病, 腸道局部炎性損傷是其重要病理改變,以大量炎性細胞浸潤腸壁和持續活化為特征[7-8]。盡管有關炎性細胞向炎癥部位募集的具體機制尚不十分清楚,但可以肯定的炎癥細胞在潰瘍性結腸炎的發生和發展過程中發揮了重要的作用。評價潰瘍性結腸炎的活動性和嚴重性，是制定正確治療方案和評估預后所必須。臨床上內鏡檢查和病理活檢是評價潰瘍性結腸炎的活動性和嚴重性的金標準，但是內鏡檢查和病理活檢不易重復進行，活檢具有創傷性。臨床迫切需要尋找新的反應潰瘍性結腸炎的活動性和嚴重性的標記物。臨床上測評UC治療過程需要客觀指標來評價病情的活動性、嚴重性，然而目前缺乏一些簡單實用、客觀敏感的評價指標[9]。

近年研究發現，表型為CD1d(hi)CD5+CD19+調節性B細胞是一種新型具有負向調節功能的B細胞，其數量和功能的異常可能是自身免疫病發生的重要機制[2]。目前，對Bregs抑制免疫炎癥的機制通過如下幾個方面實現：①Bregs主要通過分泌IL-10和TGF-β等發揮免疫調節功能。Bregs產生的IL-10通過調節T細胞分化影響疾病過程[10]， 如在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中，可調節Th1/Th2平衡抑制有害免疫應答[11]。 巨噬細胞和樹突狀細胞也是IL-10是發揮抑制性調節作用的主要靶細胞，減少巨噬細胞或單核細胞炎癥因子的釋放,減輕炎癥反應[12]。②Bregs通過細胞間接觸發揮調節作用。研究表明，Bregs通過直接的MHC和B7這2條途徑，促進調節性T細胞的增殖和活性，通過fas/fasl介導的凋亡機制來抑制效應性T細胞的增殖[13-14]。③與其他調節性免疫細胞之間的相互作用研究表明，Bregs可與CD4+T細胞共培養能數量依賴性地降低CD4+T細胞的增殖能力[15]。

本研究顯示活動期UC患者血調節性B細胞及CRP含量高于緩解期UC患者和正常者;緩解期UC患者調節性B細胞及CRP含量較正常組無明顯升高，活動其UC患者CAI評分顯著高于緩解期UC患者。活動期UC患者血調節性B細胞數量和病情嚴重性一致，與病情活動指數CAI評分呈正相關，與正常組相比，輕型活動其UC患者CRP含量無明顯升高，而血調節性調節性B細胞數量顯著升高，提示輕型活動期UC患者中血調節性B細胞較CRP更加敏感地反映出病情嚴重性的變化。

本研究結果表明活動期UC患者調節性B細胞變化可作為評價病情活動性與嚴重性的良好指標，有助于判斷臨床治療效果，評價預后。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.018

[中圖分類號]R574.62

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)22-2447-03

[收稿日期]2015-07-15