膽固醇代謝相關蛋白及相關特異microRNAs在膽固醇型膽囊結石患者血清中的表達及意義*

宋健，喻超，詹磊，張宏，趙小毅，張棟，孫誠誼

（貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004）

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論著

膽固醇代謝相關蛋白及相關特異microRNAs在膽固醇型膽囊結石患者血清中的表達及意義*

宋健，喻超，詹磊，張宏，趙小毅，張棟，孫誠誼

（貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004）

摘要：目的探討膽固醇型膽囊結石患者和健康對照人群血清中膽固醇代謝相關蛋白，以及可能靶向ABCA1的相關microR NAs（miR NAs）表達差異及意義。方法選取60例膽固醇型膽囊結石患者（結石組）和60例健康對照人群（非結石組）的血清樣本，采用Western blot檢測膽固醇代謝相關蛋白（SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11）的表達，利用生物信息學軟件預測可能靶向調控ABCA1的相關miR NAs，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（R T-qPCR）對相關miR NAs的表達進行檢測。結果結石組血清中SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11蛋白的表達量較非結石組降低（P<0.05），結石組血清中miR NA-26a、miR NA-144、miR NA-758表達較非結石組升高（P<0.05）。結論膽固醇代謝相關蛋白差異性表達及可能靶向ABCA1的相關miR NA在膽固醇型膽囊結石的發病過程中可能發揮極為重要的作用。

關鍵詞：膽固醇型膽囊結石??；膽固醇代謝；microR NAs；生物信息學

膽囊結石是一種世界范圍的常見疾病，患病人數逐年增加，各年齡段均可發病[1]。膽汁中的一種或多種成分出現失衡則有可能誘發膽囊結石的形成。以結石成分劃分，37%～86%為膽固醇型膽囊結石、2%～27%為膽色素膽囊結石、4%～16%為混合型膽囊結石[2]。膽固醇型膽囊結石的成因尤為復雜，主要可歸結于：膽固醇過度分泌及膽汁膽固醇過飽和、膽汁促成核及抗成核蛋白失衡、膽囊動力失調[3]，其中任何一個因素的積極干預都可能對治療膽囊結石起重要作用。

ATP結合盒轉運體（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）基因超家族中的ABCA1是體內膽固醇代謝的關鍵分子[4]，在膽固醇型膽囊結石形成的兩個重要生物學進程中，即膽固醇代謝和膽汁成分的影響中發揮重要的調控作用[5]。microRNAs （miRNAs）是一種內生性微小（長度為18～25個核苷酸）非蛋白編碼RNAs，幾乎存在于所有的器官組織中，且存在穩定的表達。miRNAs通過與靶向調控mRNAs的3'-UTR端結合，在轉錄后水平對mRNA的表達進行調控[6]。關于miRNAs對膽囊結石成因的相關研究極少，但大量研究證明，miRNAs可通過靶向ABCA1 mRNA對體內膽固醇代謝進行調控[7]。因此，本研究利用Western blot檢測及實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）對膽固醇型膽囊結石患者血清中膽固醇代謝相關蛋白及可能存在靶向調控ABCA1的相關miRNAs表達情況進行分析，為膽固醇型膽囊結石臨床預防和治療提供新的實驗基礎和理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月-2015年6月貴州醫科大學附屬醫院肝膽外科的60例膽固醇型膽囊結石患者血清樣本（結石組）。其中，男性22例，女性38例；年齡21～77歲，平均（53.4±6.3）歲。另收集60例在本院體檢中心體檢的健康人員血清（非結石組）作為對照。其中，男性22例，女性38例；年齡22～75歲，平均（51.6±4.9）歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。排除病毒性肝炎、心腦血管疾病、糖尿病及代謝性疾病、近3個月內有膽囊炎急性發作及使用抗生素者。對膽囊結石采用肉眼觀察結合三酰甘油檢測試劑盒（glycerol phosphate oxidase peroxidase-anti-peroxidase，GPO-PAP）測定膽固醇含量的方法對膽囊結石進行分類，總膽固醇含量≥70%為膽固醇型膽囊結石，納入實驗結石組[8]。材料的選取及標本的獲得均通過貴州醫科大學醫學研究倫理委員會，實驗在倫理委員會的監督及指導下進行。

總膽固醇試劑盒（total cholesterol，T-CHO）試劑盒（南京建成生物工程研究所），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），miRcute miRNA提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Revert Aid第一鏈cDNA合成試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Maxima-SYBR-Green/ROX-qPCR-Master Mix（美國Thermo Scientific公司），引物設計及合成（上海生工生物工程股份有限公司），SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11兔抗人單克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人單克隆抗β-肌動蛋白（以下簡稱βactin）抗體，二抗：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G抗體（北京中杉金橋生物技術，中國）。

1.2方法

1.2.1總膽固醇檢測切取部分膽結石放入預冷的研缽中磨成粉末，每個樣本精確稱取10 mg，放入15 ml離心管中，加入氯仿、甲醇混合液（體積比2∶1）14ml，充分振搖1～2min后，避光常溫放置20min，再充分振搖，2 min后，6 000 r/min×10 min，取上清液，按照T-CHO試劑盒說明書進行操作，采用單試劑GPO-PAP法測定膽固醇含量。

1.2.2外周血清采集檢測對象禁食12 h后，于次日清晨經肘靜脈穿刺采集5 ml外周全血。4℃靜置2 h至血液自凝；4℃、2000×g離心5 min，上清液轉移至新無RNA酶Eppendorf管中。4℃、12000×g離心15min，以徹底除去細胞碎片與雜質；將上清分裝至0.2 ml Eppendorf管中，置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達4℃、10 000×g離心30min，提取上清液即為總蛋白。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，取40μg總蛋白上樣；經8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，封閉液封閉3 h，分別加入一抗：兔抗人ABCA1（1∶40000）、ABCB11（1∶1000）、SREBP-2（1∶800）、FXR（1∶400）、LXR（1∶400）和抗βactin（1∶2 000），在4℃下孵育過夜；二抗在室溫下孵育2 h，增強化學發光法顯色后，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像，實驗重復3次取平均值。以β-actin為內參，檢測兩組血清的SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11平均相對表達量，以目的蛋白與內參灰度值的比值作為其蛋白表達水平。采用自動電泳凝膠成像分析軟件進行圖像掃描和分析。

1.2.4生物信息學預測以 PicTar、miRanda、DI ANA-microT-CDS、和TargetScanS 4個常用miRNA靶標預測軟件對ABCA1進行靶基因預測并結合相關文獻確立待檢測的7個miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

1.2.5R T-qPCRmiRNA抽提嚴格按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書進行。用miRNAs特異性引物和RevertAidTMM-MuLV逆轉錄酶對每個樣本中的總miRNA（0.5μg）進行逆轉錄。反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60s，共40個循環。每個反應設3個復孔，實驗重復3次，取均值，miRNAs的相對表達量用2-ΔΔCt計算。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ABC A1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR在血清中的表達

本研究首先通過Western blot檢測對60例膽固醇型膽囊結石患者和60例年齡、性別相匹配的健康人血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表達進行檢測，結果顯示，結石組患者血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表達低于非結石組（t=12.150、7.669、9.251、8.990、和10.350，P=0.000、0.001、0.000、0.000、和0.000）。見圖1。

圖1　Western blot檢測

2.2生物信息學預測

膽固醇代謝受多種蛋白的調節，SREBP-2、FXR、LXR報道較多，目前針對ABCA1對膽固醇代謝的研究較熱[9]，但其與膽固醇型膽囊結石的報道較少。故以Pic Tar、miRanda、DIANA-microT-CDS和Target Scan S 4個常用miRNA靶標預測軟件對ABCA1進行靶基因預測并結合相關文獻確立待檢測的 7個 miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

2.3兩組血清中miRNAs的表達

兩組血清中的7種miRNAs（miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758）進行RT-qPCR反應，結果顯示，結石組患者血清中的3種miRNAs（miR-26a、miR-144、miR-758）的表達水平高于非結石組（t=3.305、1.993和2.579，P=0.001、0.049和0.011），其他4種miRNAs（miR-10b、miR-33a、miR-143、miR-145）的表達水平比較，經t檢驗，差異無統計學意義（t=1.680、1.889、0.921和1.162，P=0.096、0.061、0.359和0.248）。見圖2。

圖2　兩組血清miRNAs相對表達量比較

3　討論

膽囊結石是一種常見的消化系統疾病[10]，其發病率在美國為5%～25%，在歐洲為5.9%～21.9%，在亞洲為4%～15%，在我國為3%～11%[1，11-12]。隨著經濟發展、飲食結構西化、人口老齡化加劇，我國膽囊結石患病率也逐年增加[13-14]。目前膽囊結石的治療仍以腹腔鏡膽囊切除術為主，膽囊切除后會出現膽汁反流、膽總管結石患病率升高、結腸癌發生率升高等不良后果[15-16]。國內外學界對于膽囊結石疾病的成因及膽囊結石發生風險因素的研究仍無定論，存在較大爭議。因此，從表觀遺傳學思路入手，探尋膽囊結石成石機理十分重要。

本研究選取膽固醇型膽囊結石及健康人血清為研究對象，首先通過Western blot檢測結石組與非結石組血清之間 SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11蛋白的表達，確實存在差異。有研究證明，FXR在小鼠肝內膽管結石模型中呈低表達狀態，這可能與FXR促進膽汁酸和磷脂向膽小管的分泌，進而降低膽固醇/膽汁酸的比例，即調控膽固醇的飽和度有關[17]。LXRa與脂類代謝關系密切，可激活ABCA1和ABCG5/ABCG8的表達，增加膽固醇從肝內排出[18]。SREBP-2是膽固醇生物合成途徑中的關鍵分子，降低其表達可導致膽汁中膽固醇過量分泌[19]。ABCA1、ABCB11是ABC基因超家族中的重要一員，是膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）的關鍵因素，介導細胞膽固醇外流，在膽固醇和血漿脂蛋白代謝中發揮重要作用，進而調控膽固醇輸出[20]，兩者在高膽固醇血癥、心血管疾病、丹吉爾病、糖尿病等代謝性疾病中存在明顯低表達，該低水平的表達將逆向破壞RCT過程，因此被認為是人類膽囊膽固醇結石發病可能的重要成石基因之一[21-22]。有研究認為，兩者升高可導致膽固醇型膽囊結石的形成[23]，但這樣的觀點仍然存在爭議[24-25]。筆者研究發現，兩者低表達可能導致膽固醇型膽囊結石的形成。

以上提及的膽固醇代謝相關蛋白中，ABCA1作為體內膽固醇平衡的關鍵分子[4]，在膽固醇型膽囊結石形成過程發揮重要影響，在膽固醇代謝和膽汁酸成分的平衡中起重要的調控作用[5]。研究表明，膽固醇型膽囊結石患者膽囊黏膜中ABCA1呈高表達[26]，本研究結果與其相互印證。目前針對miRNAs 與ABCA1的研究，主要集中在miRNAs靶向調控ABCA1進而形成高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥這一領域，其能極大地增加患動脈粥樣硬化的風險[27]，考慮膽固醇型膽囊結石與動脈粥樣硬化同為代謝綜合征，有相似的致病機理[28]。因此筆者推測miRNAs同樣可能靶向ABCA1，影響膽固醇型膽囊結石的形成。因此，在確定ABCA1在結石組中呈高表達后，筆者利用生物信息學技術并查閱相關文獻，選取可能對膽固醇型膽囊結石存在潛在調控作用的miRNAs[20，29-31]，并通過qPCR反應檢測miRNA的表達，其中miR-26a、miR-144、miR-758的表達相對升高，提示miR-26a、miR-144、miR-758極有可能通過靶向調控ABCA1影響膽固醇型膽囊結石的形成。

綜上所述，本研究發現膽固醇型膽囊結石患者與非結石組血清中膽固醇代謝相關蛋白（SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11）表達降低，可能存在靶向ABCA1調控的miR-26a、miR-144、miR-758表達升高，這種miRNAs特異性的表達升高可能靶向下調ABCA1，從而損害RCT過程，最終導致膽固醇型膽囊結石的形成。miR-26a、miR-144、miR-758有可能成為膽固醇型膽囊結石治療的新靶點，為最終揭示膽固醇型膽囊結石的形成機理，提供極為重要的實驗基礎及理論依據。

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（童穎丹 編輯）

中圖分類號：R 657.42

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.008

文章編號：1005-8982（2016）13-0043-05

收稿日期：2016-01-27

*基金項目：國家自然科學基金（No：81560477）；貴州省科技計劃項目[No：黔科合SY字（2015）3047]

[通信作者]孫誠誼，E-mail：sunchengyi2014@163.com；Tel：0851-86771326

Expressions and significance of cholesterol metabolism related proteins and miRNAs targeting to ABCA1 in serum of patients with cholesterol gallstones*

Jian Song，Chao Yu，Lei Zhan，Hong Zhang，Xiao-yi Zhao，Dong Zhang，Cheng-yi Sun
（Department of Hepatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou 550004，China）

Abstract:Objective To investigate the expressions of serum cholesterol metabolism related proteins and miRNAs maybe targeting to ABCA1 in the cholesterol gallstone patients and control subjects and the significance.Methods Serum samples from 60 patients with cholesterol gallstones（GS）and 60 without gallbladder stone（GP）were collected.The expressions of serum cholesterol metabolism related proteins（SREBP-2，FXR，LXR，ABCA1 and ABCB11）were examined by Western blot assay.The miRNAs possibly targeting to ABCA1 were predicted by bioinformatics method，the expressions of the selected miRNAs were detected by real timequantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results SREBP-2，FXR，LXR，ABCA1 and ABCB11 expressions in serum were significantly decreased in the GC patients compared to those in the healthy controls（P ＜0.05）.The serum expressions of miRNA-26a，miRNA-144 and miRNA-758 were significantly higher in the GC patients than in healthy controls（P ＜0.05）.Conclusions Abnormal expressions of cholesterol metabolism related proteins and the differential levels of microRNAs targeting to ABCA1 may play an important role in occurrence and development of cholesterol gallstones.

Keywords:cholesterol gallstone；cholesterol metabolism；microRNA；bioinformatics