莪術醇聯合氟尿嘧啶對裸鼠胃癌移植瘤生長、增殖細胞核抗原和P27表達的影響*

王冬，范立僑，馬希中，李勇，趙群，檀碧波，張志棟，崔平

（1.河北醫科大學第四醫院 外三科，河北 石家莊 050011；2.河北省人民醫院 醫務處，河北 石家莊 050051）

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莪術醇聯合氟尿嘧啶對裸鼠胃癌移植瘤生長、增殖細胞核抗原和P27表達的影響*

王冬1，范立僑1，馬希中1，李勇1，趙群1，檀碧波1，張志棟1，崔平2

（1.河北醫科大學第四醫院 外三科，河北 石家莊 050011；2.河北省人民醫院 醫務處，河北 石家莊 050051）

摘要：目的觀察莪術醇聯合氟尿嘧啶對胃癌裸鼠皮下移植瘤的影響。方法將人胃癌細胞株BGC823接種于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠模型。將荷瘤裸鼠隨機分為對照組、莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組（莪術醇聯合氟尿嘧啶），記錄各組的腫瘤體積和瘤重。應用熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）和免疫組織化學法檢測各組腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）、P27的表達。結果對照組腫瘤體積和重量比其他3組升高（P<0.05）；聯合用藥組腫瘤體積和重量低于莪術醇組（P<0.05）；聯合用藥組腫瘤體積和重量與氟尿嘧啶組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。各實驗組腫瘤組織中PCNA的表達均低于對照組（P<0.05）；與莪術醇組和氟尿嘧啶組比較，聯合用藥組PCNA的表達降低（P<0.05）。各實驗組移植瘤組織中P27的表達均高于對照組（P<0.05）；與莪術醇組比較，聯合用藥組P27的表達增強（P<0.05）；與氟尿嘧啶組比較，聯合用藥組P27 mR NA的相對表達有升高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。與莪術醇組和氟尿嘧啶組比較，聯合用藥組P27蛋白陽性率升高（P<0.05）。結論莪術醇聯合氟尿嘧啶能抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤的生長，其機制可能與調節PCNA、P27基因有關。

關鍵詞：莪術醇；胃癌；裸鼠皮下移植瘤；增殖細胞核抗原；P27

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率都居惡性腫瘤前列。目前胃癌的治療是以根治性手術為主，術后輔以化療，而化療的毒副作用以及對機體的免疫抑制作用，嚴重影響患者的生活質量，故近年來中藥在胃癌的輔助治療中占有越來越重要的地位[1-2]。莪術醇，又稱姜黃環奧醇，是從中藥莪術揮發油中提取的主要有效成分。已有研究表明，莪術醇對結腸癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤細胞均有明顯的抑制作用[2-5]，因而有望用于胃癌治療。但迄今莪術醇抑制胃癌生長的體內研究還不多見，與其他化療藥物聯合應用效果如何報道也沒有一致意見。筆者以人胃癌BGC823細胞裸鼠皮下移植瘤動物模型作為研究對象，分別給予莪術醇、氟尿嘧啶及莪術醇聯合氟尿嘧啶藥物干預，研究不同措施對胃癌裸鼠移植瘤的影響，并檢測增殖相關基因增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、P27的表達，為莪術醇治療胃癌的臨床應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥品莪術醇（中國食品藥品檢定研究院，純度>99%），氟尿嘧啶注射液（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，250mg/支），RPMI 1640培養基（洛斯維·帕克紀念研究所），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司）,逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,鼠抗人PCNA、P27單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），免疫組織化學法試劑盒購自北京中杉生物公司。

1.1.2細胞株人胃癌細胞株BGC823購自中國科學院上海細胞研究所，細胞在含有10%牛清及青鏈霉素抗體的RPMI 1640培養基中常規培養。

1.1.3實驗動物4周齡BALB/c-nu雄性裸鼠，體重18～23 g，購自北京華阜康生物公司，合格證號：11401300017187，在河北醫科大學第四醫院動物中心無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級環境下飼養。動物室光照充足，溫度26～28℃，相對濕度40%～60%。

1.2荷瘤裸鼠模型的建立

收集對數生長期BGC823細胞，調整細胞濃度為5×106個/ml的細胞懸液，無菌條件下將細胞懸液以0.2ml/只接種于裸鼠右前肢腋窩皮下，繼續飼養2周，建立荷瘤裸鼠模型。

1.3動物分組與給藥

待裸鼠皮下瘤生長至直徑大約10 mm時進行分組。20只裸鼠隨機分為4組：對照組（等容積生理鹽水）、莪術醇組（莪術醇注射液100 mg/kg）、氟尿嘧啶組（氟尿嘧啶注射液50 mg/kg）、聯合用藥組（莪術醇注射液100mg/kg和氟尿嘧啶注射液50 mg/kg），每組5只。均每隔4天瘤體內給藥1次，連續給藥4次。

1.4腫瘤抑瘤率的比較

末次給藥4d后脫頸處死裸鼠，完全剝取瘤體組織，測量腫瘤最長徑A（mm）和最短徑B（mm），體積（mm3）=1/2（A×B2），體積抑制率=（對照組瘤體積-實驗組瘤體積）/對照組瘤體積×100%。電子天平稱重瘤塊，按照公式計算腫瘤抑制率。重量抑制率=（對照組瘤重-實驗組瘤重）/對照組瘤重×100%。

1.5形態學觀察

取部分剝離的瘤組織以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡下觀察瘤組織細胞形態。

1.6qPCR檢測PCNA、P27 mRNA表達

Trizol試劑提取各組裸鼠皮下移植瘤組織的總RNA，具體操作按試劑盒說明書進行。提取后以紫外光度計測定其純度并定量。在PCR管中配制逆轉錄反應液，輕輕混勻，室溫放置10 min后移入42℃恒溫槽中，42℃保溫1 h進行逆轉錄反應，反應結束后在冰水中冷卻2min，所得反應液用于PCR反應。引物序列如下：PCNA正向引物為5'-GCCGAGATCTC AGCCATATT-3'，反向引物為5'-ATGTACTTAGAGG TACAAAT-3'；P27正向引物為5'-CCGACGATTCTT CTACTC-3'，反向引物為5'-CTGATAAACAAGGAAA CT-3'；甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。取逆轉錄產物5μl為PCR反應模板，反應體系為20μl。擴增條件：①PCNA。94℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，72℃繼續延伸5 min。②P27，94℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，72℃繼續延伸5min。以上循環進行40次，擴增完畢后進行結果分析。

1.7免疫組織化學法檢測PCNA和P27蛋白的表達

腫瘤組織置于10%中性甲醛中固定24 h，經脫水、透明、滲蠟、石蠟包埋，以4μm厚度連續切片后行免疫組織化學染色，方法參照試劑盒說明書。免疫組織化學結果判斷：在每張切片中隨機選取6個不同視野，在高倍鏡下觀察，以此來評判腫瘤細胞染色的著色率。PCNA蛋白陽性染色在胞核，P27蛋白陽性染色在胞漿，以出現淡黃色至棕黃色顆粒沉著為陽性。以高倍鏡下計數100個細胞中陽性細胞所占百分比為陽性表達率，取6個視野的平均值。病理結果均由病理醫師盲法評定。

1.8統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，各組不同時間點細胞活性比較用重復測量方差分析，用SNK法進行兩兩比較；計數資料以率或百分比表示，用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組裸鼠腫瘤生長情況

裸鼠荷瘤生長結果表明，對照組、莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組的腫瘤體積分別為（2195.83± 54.00）、（1 795.48±56.86）、（1 439.50±31.13）和（1 363.40±37.54）mm3。4組體積比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=434.291，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組腫瘤終體積與對照組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=11.416、27.133和28.303，P=0.000）。4組腫瘤體積抑制率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=51.591，P= 0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組腫瘤體積抑制率與對照組比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=20.095、41.604和46.761，P=0.000）。

對照組、莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組的腫瘤重量分別為（1.88±0.09）、（1.51±0.09）、（1.18± 0.02）和（1.05±0.10）g。4組重量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=92.040，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組腫瘤重量與對照組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.500、16.978和13.795，P=0.000）。4組重量抑制率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=58.659，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組腫瘤重量抑制率與對照組比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=21.828、38.735和56.657，P=0.000）。見表1、2和圖1。

表1　各組的腫瘤體積、重量比較 （n=5±s）

表1　各組的腫瘤體積、重量比較 （n=5±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與莪術醇組比較，P<0.05

組別　移植瘤平均重量/g對照組　2195.83±54.00　1.88±0.09莪術醇組　1795.48±56.861）　1.51±0.091）腫瘤終體積/mm3氟尿嘧啶組聯合用藥組1439.50±31.131）1363.40±37.541）2）1.18±0.021）1.05±0.101）2）F值　434.291　92.040 P值　0.000　0.000

2.2各組腫瘤細胞活性情況（MTT結果）

重復測量的方差分析結果顯示，各組腫瘤細胞活性與處理方式及時間都有關系。各組間細胞活性不同，差異有統計學意義（F組間=21.582，P組間=0.000）；各組細胞隨時間延長活性逐漸升高，差異有統計學意義（F時間=340.020，P時間=0.000）；不同處理措施和時間之間存在交互作用（F交互=4.061，P交互=0.000）。見表3。

表2　各組的腫瘤體積和腫瘤重量抑制率比較（n=5，%）

2.3PCNA、P27 mRNA在各組裸鼠胃癌組織中的表達

qPCR結果顯示，各組PCNAmRNA的相對表達量不同，差異有統計學意義（F=102.272，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組裸鼠胃癌移植瘤組織中PCNAmRNA的相對表達量均低于對照組，差異有統計學意義（t=3.668、6.692和14.189，P= 0.006、0.000和0.000）。各組P27 mRNA的相對表達量不同，差異有統計學意義（F=35.163，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組P27 mRNA的相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義（t= -5.065、-7.837和9.334，P=0.000）。

圖1　各組裸鼠皮下移植瘤情況

表3　各組腫瘤細胞活性情況 （n=5±s）

表3　各組腫瘤細胞活性情況 （n=5±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。F組間=21.582，P組間=0.000；F時間=340.020，P時間=0.000；F交互=4.061，P交互=0.000

組別0h 24h 48h 72h對照組　0.129±0.023　0.236±0.045　0.512±0.056　0.702±0.051莪術醇組　0.131±0.019　0.232±0.041　0.416±0.068?　0.623±0.058?氟尿嘧啶組　0.126±0.020　0.238±0.037　0.382±0.069?　0.562±0.061?聯合用藥組　0.128±0.021　0.234±0.050　0.358±0.067?　0.519±0.082?

圖2　P27蛋白在各組腫瘤組織中的表達 （免疫組織化學法×400）

各組PCNA蛋白的相對表達量不同，差異有統計學意義（F=177.139，P=0.000）。莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組PCNA蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義（t=10.835、23.333和24.741，P=0.000）。各組P27蛋白的相對表達量不同，差異有統計學意義（F=541.010，P=0.000）；莪術醇組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組P27蛋白的相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義（t=-12.623、-19.194和-25.839，P=0.000）。見圖2、3和表4、5。

圖3　PCNA蛋白在各組腫瘤組織中的表達 （免疫組織化學法×400）

表4　各組PCNA和P27 mRNA的表達情況 （n=5±s）

表4　各組PCNA和P27 mRNA的表達情況 （n=5±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與莪術醇組比較，P<0.05；3）與氟尿嘧啶組比較，P<0.05

組別PCNAmRNA P27mRNA對照組　1.0015±0.0682　1.010±0.1746莪術醇組　0.8673±0.04521）　1.8307±0.31751）F值　102.272　35.163 P值　0.000　0.000氟尿嘧啶組聯合用藥組0.7553±0.04601）0.5327±0.02841）2）3）2.0274±0.23191）2.5566±0.32681）2）

表5　各組PCNA和P27蛋白的表達情況 （n=5±s）

表5　各組PCNA和P27蛋白的表達情況 （n=5±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與莪術醇組比較，P<0.05；3）與氟尿嘧啶組比較，P<0.05

組別PCNA蛋白P27蛋白對照組　0.7356±0.0226　0.3367±0.0236莪術醇組　0.5694±0.02581）　0.5106±0.01981）F值　177.139　541.010 P值　0.000　0.000氟尿嘧啶組聯合用藥組0.4405±0.01701）0.4017±0.02901）2）0.6028±0.02011）0.7167±0.02291）2）3）

3　討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，但我國早期胃癌僅占所有胃癌患者的10%左右[6]。由于早期胃癌無明顯癥狀及缺乏特異性的篩選指標，因此多數患者就診時已處于中晚期，手術效果不佳或失去手術機會。此時，以化療為主的綜合治療對提高患者的生存期起著重要的作用，氟尿嘧啶等嘧啶類藥物是胃腸道等多種腫瘤治療的一線藥物，用其化療有許多毒副作用，使得患者難于耐受而放棄或不能堅持治療。因此，尋找減輕化療毒物作用、提高生活質量的方法或藥物就有著重要意義。中藥提純物作為胃癌治療的輔助用藥已廣泛應用于臨床，可減輕化療毒副作用，提高患者生存質量，對化療藥具有增效增敏作用。

莪術醇是中藥莪術的主要有效成分，已被證實對多種疾病的治療有效。研究表明，莪術醇能明顯抑制結腸癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤細胞的生長[2-5]。但該類研究以體外實驗為多，有關莪術醇體內治療胃癌的效果研究還不多見。本研究中筆者對莪術醇體內抑制胃癌生長的作用機制進行分析，結果顯示，莪術醇對裸鼠皮下移植瘤的生長有明顯的抑制作用，莪術醇作用后腫瘤的體積和重量都受到明顯抑制，說明莪術醇有明顯的抗癌效果。結果還發現莪術醇和氟尿嘧啶聯合應用效果更為顯著，提示莪術醇與氟尿嘧啶在胃癌治療中可能具有協同作用，在臨床聯合應用莪術醇和氟尿嘧啶有望提高化療效果。

為探討莪術醇抑制胃癌生長的機制，筆者進一步檢測各組腫瘤組織中PCNA、P27的表達情況。PCNA合成量在細胞周期的G1期逐漸增加，到S期達高峰，G2期開始下降，與細胞DNA的合成密切相關，在細胞增殖周期中起著重要作用，其表達量與DNA合成量變化一致，是直接反映細胞增殖能力的指標[7]。P27可以與周期素依賴性蛋白激酶結合，對細胞周期進行調控，為重要的細胞周期負性調控因子，其缺失與腫瘤的發生和發展有著重要關系[8]。本研究結果顯示，莪術醇作用后可以明顯抑制PCNA的表達，同時促進P27表達，提示莪術醇可能通過調控上述基因而抑制胃癌生長。但腫瘤的生長機制復雜，本研究僅檢測莪術醇作用后兩種基因的改變，且沒有進行深入的機制研究，這是明顯不足的，需要進一步的深入研究確定莪術醇抗胃癌的具體機制。

本研究顯示莪術醇可以抑制裸鼠胃癌移植腫瘤的生長，且與氟尿嘧啶具有協同作用，其機制可能莪術醇與下調PCNA而上調P27基因有關。本研究為莪術醇胃癌應用提供一定依據，但本研究內容較為簡單，還有待進一步的分子實驗和臨床實驗予以證實。

參考文獻：

[1]ZHAO C,CHEN J,YU B,et al.Effect of modified taohongsiwu decoction on patients with chemotherapy-induced hand-foot syndrome[J].J Tradit Chin Med,2014,34(1):10-14.

[2]WANG J,HUANG F,BAI Z,et al.Curcumol inhibits growth and induces apoptosis of colorectal cancer LoVo cell line via IGF-1R and p38 MAPK pathway[J].Int J Mol Sci,2015,16(8): 19851-19867.

[3]TANG Q L,GUO J Q,WANG Q Y,et al.Curcumol induces apoptosis in SPC-A-1 human lung adenocarcinoma cells and displays anti-neoplastic effects in tumor bearing mice[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(6):2307-2312.

[4]張弘,張連榮,姜海軍,等.莪術醇對人胃癌細胞株BGC823增殖的影響及其機制[J].中華實驗外科雜志,2015,32(10):2444-2447.

[5]馬琨,胡國強.莪術醇誘導人骨肉瘤MG63細胞自噬的實驗研究[J].中成藥,2015,37(2):268-272.

[6]LI Y,ZHAO Q,FAN L Q,et al.Analysis of lymph node dissection range-related factors for early gastric cancer operation[J]. Hepato-Gastroenterology,2013,60(125):971-974.

[7]LI N,DENG W,MA J,et al.Prognostic evaluation of nanog, Oct4,Sox2,PCNA,Ki67 and E-cadherin expression in gastric cancer[J].Med Oncol,2015,32(1):433.

[8]LEE S R,SHIN J W,KIM H O,et al.Determining the effect of transforming growth factor-β1on cdk4 and p27 in gastric cancer and cholangiocarcinoma[J].Oncol Lett,2013,5(2):694-698.

（申海菊編輯）

中圖分類號：R 735.2

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.001

文章編號：1005-8982（2016）13-0001-06

收稿日期：2015-12-28

*基金項目：國家自然基金面上項目（No：81372580）；河北省中醫藥管理局項目（No：2014145D）

［通信作者］李勇，E-mail：li_yong_hbth@126.com；Tel：0311-86095678

Effect of curcumol combined with fluorouracil on growth of gastric cancer implantation tumor in nude mice and expressions ofPCNA andP27genes*

Dong Wang1，Li-qiao Fan1，Xi-zhong Ma1，Yong Li1，Qun Zhao1，Bi-bo Tan1，Zhi-dong Zhang1，Ping Cui2
（1.The Third Department of General Surgery，the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；2.Division of Medical Affairs，Hebei General Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China）

Abstract:Objective To observe the effect of curcumol combined with fluorouracil（FU）on subcutaneous transplantation tumor tissues of gastric cancer cells in nude mice.Methods The implantation tumor model was built by subcutaneous inoculation of human gastric cancer cell line BGC823 in nude mice.The tumor-bearing mice were randomly divided into control group，curcumol group，FU group and combination group（curcumol combined with FU）.Data of tumor volume and weight of each group were collected.Expressions ofPCNAandP27genes in tumors of the 4 groups were detected with qPCR and immunohistochemistry.Results The tumor volume was significantly smaller and the tumor weight was significantly lower in the 3 experimental groups than in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group，the tumor volume was significantly smaller and the tumor weight was significantly lower in the combined group（P＜0.05）.The volume and weight of the tumors had no significant differences between the FU group and the combined group（P＞0.05）.The expression of thePCNAin the experimental groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group and the FU group，the expression ofPCNAin tumor tissues of the combined group significantly decreased（P＜0.05）.The expression of theP27in the 3 experimental groups was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）. Compared with the curcumol group，the expression ofP27in the combined group significantly increased（P＜0.05）. There was no significant difference inP27mRNA of tumor tissues between the combined group and the FU group（P＞0.05）.The positive percentages of p27 protein in the 3 experiment groups were significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group and the fluorouracil group，the positive percentages of PCNA protein in the combined group was significantly higher（P＜0.05）.Conclusions Curcumol combined with FU could inhibit the growth of subcutaneous transplantation tumor of human gastric cancer cells in nude mice，which might be related to regulation ofPCNAandP27genes.

Keywords:curcumol；gastric cancer；subcutaneous transplantation tumor of nude mice；proliferating cell nuclear antigen；P27