異補(bǔ)骨脂素對(duì)氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

馮春燕，陳　　勝，胡艷紅，柯發(fā)杰，胡　　俊，黃秀榕，祁明信（.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；.福建中醫(yī)藥大學(xué)病理生理研究中心，福建 福州 350）

異補(bǔ)骨脂素對(duì)氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

馮春燕1，陳勝1，胡艷紅1，柯發(fā)杰1，胡俊1，黃秀榕2，祁明信1
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；
2.福建中醫(yī)藥大學(xué)病理生理研究中心，福建 福州 350122）

目的觀察異補(bǔ)骨脂素對(duì)氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響。方法實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、H2O2組、E2組、ISR組，密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果正常對(duì)照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷；H2O2組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失，線粒體受損傷；E2組、ISR組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好。結(jié)論異補(bǔ)骨脂素對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。

異補(bǔ)骨脂素；氧化損傷；人晶狀體上皮細(xì)胞；線粒體

異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen，ISR）是從補(bǔ)骨脂中提取的有效單體，我們課題組前期研究［1-4］發(fā)現(xiàn)ISR和雌二醇（β-Estradiol，E2）一樣具有雌激素作用，能夠增強(qiáng)抗氧化能力，提高人晶狀體上皮細(xì)胞（human lens epithelia cell，HLEC）內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性；提高 HLEC內(nèi) SOD mRNA、GSH-px mRNA、CAT mRNA的表達(dá)，減輕HLEC氧化損傷，對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLEC發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分離HLEC線粒體，用透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)，探討ISR保護(hù)氧化損傷的HLEC亞細(xì)胞水平的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1材料與方法

1.1材料3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1mol/L磷酸緩沖液、1%鋨酸亞鐵-1.5%氰化鉀混合液、醋酸鈾、檸檬酸鉛、MTT干粉（美國(guó)Sigma公司）；Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells（鷺隆生物科技有限公司）；異補(bǔ)骨脂素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度99.5%）；E2（美國(guó)Sigma公司，純度97%）；二甲基亞砜（美國(guó)Amresco公司）；乙二胺四乙酸（美國(guó)Augus公司）；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基干粉（美國(guó)Gibco公司）；新生小牛血清 （奧地利Paa公司），H-7650電子顯微鏡（日本日立公司）；UC-6超薄切片機(jī)（美國(guó)LaiCa公司）；常溫離心機(jī)、低溫離心機(jī)（德國(guó)Heraeus Inc.公司）；-80℃低溫冰箱（英國(guó)New Brunswick Scientific Inc.公司）；IMT-413倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma公司）；超凈工作臺(tái)（江蘇SW-CJ-IF）。

1.2HLEC培養(yǎng)及傳代采用永生化人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3。取出凍存管中的HLE-B3立即放入37℃水中，將溶解的細(xì)胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)x心，去上清，反復(fù)洗滌3次。以5×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組① 正常組：HLEC加 DMEM培養(yǎng)液；② H2O2組：正常組加H2O2（終濃度300 μmol/ L）；③ E2組：H2O2組加E2（終濃度10-2μmol/L）；④ISR組：H2O2組加ISR（終濃度10 μmol/L）。

1.4細(xì)胞線粒體分離①收集2×107細(xì)胞于2 mL微量離心管，離心850×g，2 min，棄上清；② 加800 μL線粒體分離試劑A于離心管，以中等速度漩渦5 s，冰上孵育2 min；③ 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)于冰冷的杜恩斯組織研磨器，充分勻漿細(xì)胞；④ 將勻漿液移到原離心管中，加800 μL線粒體分離試劑C，200 μL線粒體分離試劑A，混勻，離心700×g，10 min，4℃；⑤ 轉(zhuǎn)上清液于一新離心管，離心3 000× g，15 min，4℃；⑥轉(zhuǎn)上清液于一新離心管，加500 μL線粒體分離試劑C，離心12 000×g，5 min，4℃棄上清，所得沉淀即為線粒體。

1.5透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)① 前固定：分離出的HLEC線粒體以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液-0.1M PBS（pH 7.2）4℃過(guò)夜；② 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；③后固定：1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀4℃ 1.5 h；④ 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；⑤ 脫水：50%酒精10 min→70%酒精飽和醋酸鈾染液4℃過(guò)夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→無(wú)水丙酮10 min×3次；⑥ 浸透：無(wú)水丙酮+環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑（1∶1）1.5 h，純618包埋劑 35℃3 h；⑦ 包埋、聚合：35℃12 h、45℃ 12 h、60℃ 3 d；⑧切片、染色：超薄切片機(jī)切70～80 nm的超薄切片；經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，并蒸餾水水洗；⑨ 透射電鏡下觀察并攝片。

2結(jié)果

2.1線粒體分離純化質(zhì)量鑒定各組HLEC線粒體電鏡觀察顯示：線粒體聚集，其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本未見(jiàn)，說(shuō)明線粒體分離純化良好。

2.2ISR對(duì)氧化損傷的HLEC內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響① 正常對(duì)照組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷，見(jiàn)圖1。②H2O2組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失，線粒體受損傷，見(jiàn)圖2。③E2組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見(jiàn)圖3。④ ISR組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見(jiàn)圖4。

3討論

3.1文獻(xiàn)［5］表明，白內(nèi)障的發(fā)病率呈男女性別差異，女性高于男性，且絕經(jīng)后表現(xiàn)更為明顯。Krishnaiah等［6］發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后接受激素替代治療的女性白內(nèi)障患病率明顯低于未使用者及同齡男性，激素替代治療對(duì)皮質(zhì)性、核性、后囊下性白內(nèi)障有保護(hù)作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障的發(fā)生與缺乏雌激素的保護(hù)有關(guān)［8］，雌激素能夠減輕晶狀體氧化損傷程度［9-10］，抑制HLEC凋亡，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起一定的作用。

3.2ISR是從補(bǔ)骨脂中提取的有效單體，我們前期研究發(fā)現(xiàn)ISR和E2發(fā)揮相同的作用，具有雌激素樣活性，能夠增強(qiáng)抗氧化能力，提高HLEC內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-px、CAT活性，提高HLEC內(nèi)的SODmRNA、GSH-pxmRNA、CATmRNA的表達(dá)，減輕HLEC氧化損傷，從而對(duì)氧化損傷的HLEC發(fā)揮保護(hù)作用。線粒體是一種真核細(xì)胞中普遍存在的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化及形成ATP的主要場(chǎng)所，故有細(xì)胞“動(dòng)力工廠”之稱(chēng)。目前純化線粒體的方法主要是差速離心結(jié)合密度梯度離心。密度梯度介質(zhì)一般采用Percoll密度梯度和蔗糖密度梯度，提取的線粒體都需要進(jìn)行純度評(píng)價(jià)。純度評(píng)價(jià)一般從3個(gè)方面進(jìn)行：形態(tài)學(xué)觀察、特異酶活性測(cè)定、特異抗體檢測(cè)，形態(tài)學(xué)觀察一般采用透射電鏡來(lái)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，并通

過(guò)透射電鏡鑒定，發(fā)現(xiàn)各組線粒體聚集，其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本未見(jiàn)，分離純化良好。可見(jiàn)密度梯度離心法是分離出HLEC線粒體的有效方法。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：正常對(duì)照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷。經(jīng)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后，HLEC的線粒體形態(tài)發(fā)生改變，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失；E2在保護(hù) H2O2誘導(dǎo)氧化損傷 HLEC的同時(shí)，也保護(hù)了HLEC線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。ISR和E2一樣在保護(hù)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷HLEC的同時(shí)，也保護(hù)了HLEC線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明ISR對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。

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R776

B

1000-338X（2016）03-0018-02

2016-03-02

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2014J05093），福建省創(chuàng)新課題（2014-CXB-21）

馮春燕（1979—），女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障的基礎(chǔ)與臨床研究。

祁明信（1945—），男，教授，主任醫(yī)師。E-mail：qihuang@ netease.com