三峽庫區消落帶兩種草本植被土壤細菌群落多樣性

任慶水,馬　朋,李昌曉,秦紅,楊予靜

西南大學生命科學學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶　400715

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三峽庫區消落帶兩種草本植被土壤細菌群落多樣性

任慶水,馬朋,李昌曉*,秦紅,楊予靜

西南大學生命科學學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶400715

摘要:在三峽庫區消落帶植被重建區域,選取兩種人工草本植被—牛鞭草與狗牙根(處理組),并以裸地土壤為對照,研究植被修復與重建對土壤細菌群落多樣性的影響。采用分子生物學T-RFLP技術,分別于2012年7月(T1)、2013年7月(T2)及2014年7月(T3)進行原位取樣,對消落帶人工植被牛鞭草、狗牙根及裸地土壤細菌群落多樣性進行了研究。結果表明：(1)除HhaⅠ酶切結果中,物種因素對消落帶土壤細菌Shannon-Wiener指數(H)、時間因素對土壤細菌Simpson指數(D)無顯著影響外,采用兩種酶切之后(HhaⅠ酶、MspⅠ),物種、時間、以及兩者的交互作用均對三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性指數產生顯著影響；(2)HhaⅠ酶切后人工植被土壤豐度與裸地相比顯著升高,此外,兩種酶切結果均表明,人工植被土壤細菌群落多樣性指數與裸地相比更加穩定。(3)植被類型、取樣時間不同,土壤中的優勢片段種類與豐度均不相同；(4)CCA分析結果表明三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性與化學性質關系密切。研究表明牛鞭草與狗牙根栽植后土壤細菌群落多樣性指數的更加穩定,三峽庫區進行植被恢復與重建值得肯定。

關鍵詞：T-RFLP；三峽庫區；消落帶；植被修復；細菌群落多樣性

消落區是指因水體水位季節性漲落使土地周期性淹沒和出露成陸地形成的水陸銜接地帶[1]。三峽工程竣工后,水庫實施冬蓄夏排的反季節水位調度管理方式,形成垂直落差達30m的三峽庫區消落帶[2- 3]。在該消落帶特殊的水文變化下,植被退化嚴重,物種多樣性低[4],消落帶中優勢物種退化[5],進而導致生態系統水土保持功能和自身修復能力的下降,引起土壤侵蝕、土地退化等問題[6]。植被具有固持水土[7]、提高土壤肥力[8]、降低水土污染等作用,因此進行三峽庫區的生態修復,在庫周進行植被重建十分必要。已有研究表明,扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)、狗牙根(Cynodon dactylon)可以適應水淹及干旱環境,被列為三峽庫區消落帶人工植被構建的優良物種[9- 10]。

目前對牛鞭草及狗牙根的研究主要集中在水分脅迫條件下根系酶活性變化[11- 12],水淹條件對兩種植被存活及恢復生長的影響[13],及二者的光合特性等方面[14- 15]。但牛鞭草、狗牙根植被構建后,對土壤中微生物,尤其是對占微生物總數70%—80%、多樣性最豐富[16]的細菌群落多樣性的深入研究還少見報道。而土壤地上部分與地下部分相互作用、相互影響,土壤的形成發育勢必會影響到地上植被的生長狀況,如土壤的理化、微生物性質均會直接或間接作用于庫區植物群落,其中,土壤細菌群落是土壤中最活躍的組分之一,它們參與土壤形成[17]、有機質分解、養分轉化和循環[18- 19]等,通過影響土壤理化性質、生物學特性及其變化過程而調節土壤質量[20- 21],其新陳代謝產物影響著植物的生長吸收和利用,為更好了解植被生長狀況,我們對土壤中細菌群落多樣性進行了分析。末端限制性片段長度多態性分析(Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP),是在PCR技術和RFLP技術基礎上發展起來的微生物群落分析技術,這種技術克服了傳統培養方法的局限性,重復性好,分析精度較高,可以利用網上數據進行資源共享[22-24],被成功用于不同環境中細菌群落多樣性研究[25]。其中,限制性內切酶的選擇是影響群落分析結果的重要因素[26],不同的內切酶產生的T-RF數目、大小均存在差異[27-28],影響對研究結果的分析。 HhaⅠ和MspⅠ兩種限制酶應用廣泛且效果較好,本研究采用上述兩種酶進行分析,并將兩種酶切結果及圖譜進行綜合比較,利于提高檢出效率。

該技術在土壤微生物方面已被廣泛應用,如根據甲烷氧化菌的相關基因設計引物,研究稻田土壤甲烷氧化菌群落的多樣性[29]；利用T-RFLP技術分析土壤微生物群落結構特征與動態變化[30]；分析美國西南部4種不同性質土壤中的微生物群落等[31],然而該技術在三峽庫區消落帶中用以研究微生物群落的多樣性還少見報道。因此,本研究以三峽庫區消落帶(重慶忠縣汝溪河流域)為研究區域,選取牛鞭草與狗牙根2種植被類型,采用分子生物學T-RFLP技術(1)研究植被修復與重建對土壤細菌群落多樣性的影響；(2)分析人工植被修復土壤和裸地土壤化學性質與細菌群落的相關性,為深入探究消落帶土壤細菌群落的變化規律,了解三峽庫區消落帶植被修復與重建對土壤微生物菌群多樣性的影響提供參考。

圖1　研究區域Fig.1　Research region

1研究地點與方法

1.1研究區概況

本研究區域位于三峽庫區重慶忠縣境內的汝溪河流域,位于重慶市中部(107°32′—108°14′E, 30°03′—30°35′N),與萬壽、石柱、豐都相接壤,距離忠縣城區32km,遠離重慶主城區(圖1)。該地區屬亞熱帶東南季風氣候,季節分明,降雨充沛,年均降雨量1200mm；光照充足,日照率29%,日照時數為1327.5h；年均氣溫19.2℃。該區域土壤主要為石灰性紫色土,土壤熟化程度較低,水土流失、土層侵蝕現象嚴重。

為進行三峽水庫庫岸帶植被修復,課題組于2012年3—4月在重慶忠縣石寶鎮汝溪河流域構建植被生態修復示范基地,基地內土壤質地、肥力狀況基本一致。在160m—170m海拔區間栽植扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)、狗牙根(Cynodon dactylon)等物種,所選岸坡樣地平均坡度為26°,岸坡上接受光照輻射強度大致相同,土壤預熱條件基本一致,每種植被類型下的采樣面積約為150m2,植被覆蓋率為80%。取樣時,植被生長狀況良好。

1.2樣品采集與土壤化學性質測定

據水位在忠縣汝溪河流域的變化及植被生長情況,分別于2012年7月(T1)、2013年7月(T2)以及2014年7月(T3)進行野外取樣調查。

采樣時在海拔160m—170m中間地帶劃定S形取樣帶。取樣時,在S形樣帶內劃定取樣樣方,每種植被類型隨機設置3塊5m×5m樣地,每個樣地內按梅花形設置5個重復取樣點,去除表層地被物后,采集0—20cm土層的原狀土壤樣品,采用IQ150土壤原位pH計(IQScientificInstruments,Inc.,SanDiego,CA,USA)測定土壤pH。同時選取試驗區域內相同海拔段的無植被裸地土壤作為對照,取樣方法同上。另外,將每個樣地的土壤樣品按四分法混合,冷凍運輸帶回實驗室以備生化性質分析。

土壤樣品分為兩部分,一部分于-80℃冰箱貯存用于細菌群落分析,剩余土壤樣品自然條件風干,研磨過篩(1mm和0.25mm),用于其他土壤化學性質的測定。土壤有機質(OM)測定采用重鉻酸鉀外加熱法；土壤全氮(TN)含量測定采用元素分析儀測定(ElementarVarioEL,Germany)；土壤堿解氮(AN)含量測定采用堿解-擴散法；土壤全磷(TP)、速效磷(AP)含量測定采用鉬銻抗比色法；全鉀(TK)、速效鉀(AK)含量測定采用原子吸收光譜儀(AA800,PEInc.,USA)。

1.3基于T-RFLP的細菌群落結構分析1.3.1土壤DNA提取

本研究土壤總DNA提取采用UltraCleanTMSoilIsolationDNAKit(購于美國MOBIO公司),操作步驟按照使用說明書進行。提取的總DNA經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,然后將總DNA置于-20℃保存備用。

1.3.2PCR擴增

PCR擴增采用通用引物擴增細菌16SrRNA,正向引物為63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC- 3′),且正向引物5′端用6-FAM進行熒光標記,反向引物為1389R(5′-ACGGGCGGTGTGTACAAG- 3′)。PCR引物由深圳華大基因公司合成并標記。PCR擴增體系為50μL,包括：模板2μL,正反向引物各0.5μL,TaqPCRMastermix25μL,補充ddH2O至50μL。設置兩個重復。PCR反應條件：95℃,5min。30個循環為：94℃,1min；56℃,1min；72℃,2min；72℃終延伸10min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性。擴增產物混合后(共100μL)用PCR純化試劑盒純化,操作步驟按說明進行。TaqPCRMastermix和PCR純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3.3T-RFLP試驗

末端熒光標記的PCR純化后產物用限制性內切酶HhaⅠ、MspⅠ(購自上海生工生物有限公司)酶切,反應體系30μL,DNA300ng,37℃下消化3h；升溫至65℃將酶滅活20min以終止反應。酶切產物送至上海Invitrogen生命技術公司(LifeTechnologies)進行基因掃描,得到T-RFLP圖譜。

1.4統計分析

統計分析前,刪除大小在50bp以下且相對峰面積小于1%的片段。以T-RFLP圖譜中限制性片段(TerminalRestrictionFragment,T-RF)為一個OTU,以該T-RF的相對峰面積作為對應的OTU的豐度。T-RF相對峰面積通過公式Ap = ni/ N × 100%計算(ni為圖譜中單個T-RF的峰面積,N為所有峰面積的總和),并計算以下多樣性指數：

物種豐度S=圖譜中峰的總數

Shannon-Wiener指數(H)

Simpson指數(D)：

均勻度指數(E)：

E=H/(lnS)

其中,Pi為某個峰的峰高占總峰高的比例。

利用PhylogeneticAssignmentTool(PAT,http://mica.ibest.uidaho.edu/pat.php)對T-RFs進行定性分析。

采用重復測量方差分析(Repeated-measuresANOVA)分析物種、時間因素及二者交互作用對土壤細菌群落多樣性的影響；采用單因素方差分析(One-wayANOVA)分析相同物種不同取樣時間多樣性指數的顯著性差異,用Duncan檢驗法檢驗每個指標在不同用地類型間的差異性(α=0.05)；用典范對應分析(CCA)檢驗土壤細菌與土壤化學性質的關系。研究采用SPSS17.0軟件和Canoco4.5進行數據分析,用Origin8.6和CanoDrawforWindows4.5軟件制圖。

2結果與分析

2.1三峽水庫消落帶土壤細菌群落多樣性指數重復度量方差分析

對土壤細菌群落的多樣性指數進行重復度量方差分析表明, HhaⅠ酶切結果中,物種因素對消落帶土壤細菌Shannon-Wiener指數(H)、時間因素對土壤細菌Simpson指數(D)無顯著影響(P>0.05,表1)。除上述結果外,物種、取樣時間、以及兩者的交互作用均對三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性指數產生顯著(P<0.05,表1)或極顯著(P<0.01,表1)影響。

表1　土壤細菌群落多樣性指數的重復度量方差分析

S: 豐度指數(Richnessindex),H: 香農指數(ShannonWienerindex),D: 辛普森指數(Simpson),E: 均勻度指數(Evennessindex)

2.2三峽水庫消落帶土壤細菌群落多樣性指數變化

兩種人工植被土壤細菌群落多樣性指數變化與裸地相比不盡相同。由HhaⅠ酶切后土壤細菌多樣性指數變化可知(圖 2a),裸地土壤的物種豐度在T1與T2時存在顯著差異,香農指數、均勻度指數均在T1與T3時存在顯著差異；與之相反,人工植被類型下,無論是牛鞭草還是狗牙根,其土壤細菌群落多樣性指數在三次取樣時均無顯著差異存在。此外,研究還發現,人工植被實生土壤下的物種豐度顯著高于裸地土壤(P<0.05)。

圖2　 不同取樣時間土壤細菌群落多樣性指數變化Fig.2　Variations of bacteria diversity in different time

與HhaI類似,MspⅠ酶切結果(圖 2b)表明,裸地的物種豐度、香農指數、均勻度指數在三次取樣中存在顯著差異,其中裸地土壤的物種豐度在T1與T2時存在顯著差異,香農指數、均勻度指數均在T1與T3時存在顯著差異。而人工植被類型下土壤細菌多樣性指數無顯著改變。

2.3三峽水庫消落帶土壤細菌群落優勢種群豐度變化

每一個T-RF至少代表數據庫中的一種細菌,因此T-RF的多樣性,也代表了細菌種類的多樣性。如圖所示,柱狀堆疊圖分別表示不同時間采樣下,人工植被與裸地土壤中優勢片段的種類與相對豐度。從T-RFLP分析圖譜中可知,經HhaⅠ酶切共得到25個優勢末端限制性片段(圖3a),經MspⅠ酶切共得到21個優勢末端限制性片段(圖3b)。圖3aHhaⅠ酶切結果顯示,473bp等T-RFs在土壤中普遍存在,而其相對豐度則在不同人工植被及裸地土壤中不盡相同；與之類似,MspⅠ酶切之后,101、110bpT-RFs也在土壤中普遍存在。然而,不同植被類型下,優勢片段的種類與豐度均不同,且隨時間呈現不同的變化趨勢。例如,經HhaⅠ酶切牛鞭草土壤中167bp(可能為Pseudomonas)、181bp(可能為Bacillus芽孢桿菌屬),狗牙根實生土壤中147bp(可能為Bacillus芽孢桿菌屬)、328bp(可能為Pseudoalteromonas假交替單胞菌屬),335bp(可能為Marinimicrobium海桿菌屬),裸地土壤中的97bp(可能為Pseudomonas aeruginosa綠膿桿菌)、167bp(可能為Pseudomonas假單胞菌)；以及經MspⅠ酶切牛鞭草土壤中90bp(可能為Aeromonas氣單胞菌),112bp(可能為假單胞菌屬Pseudomonas),狗牙根實生土壤中90bp(可能為Aeromonas),裸地土壤中112bp(可能為Pseudomonas)在三次取樣時其相對豐度持續降低或消失；另有部分優勢物種在T1、T2、T3三次取樣時相對豐度呈現先下降后上升的趨勢。

圖3　土壤細菌群落優勢T-RF的相對豐度Fig.3　Relative abundance of predominant T-RFs

2.4三峽水庫消落帶土壤細菌群落多樣性與土壤養分的關系

土壤細菌群落種類與土壤養分含量息息相關,然而土壤養分含量究竟如何影響土壤細菌群落尚不清楚,三次取樣時土壤化學性質均值如下(表2)。本研究采用典范對應分析(CCA)對消落帶土壤細菌群落進行排序,結果如圖所示。用HhaⅠ酶切得到的數據進行分析可知,排序軸CC1解釋了群落結構和物種變化信息量的46.4%,排序軸CC2解釋了27.1%,兩軸共解釋了全部信息的73.5%(圖4a)。同樣,MspⅠ酶切數據分析結果可知,排序軸CC1解釋了群落結構和物種變化信息量的29.1%,排序軸CC2解釋了15.8%,兩軸共解釋了全部信息的43.9%(圖4b)。兩種酶切之后,較大酶切片段分布相對集中,且主要分布在N、P周圍；此外,HhaⅠ酶切之后304bp(可能代表的微生物為Rhizobiales)、335bp(可能代表的微生物為Rhizobium)均在AN周圍分布；MspⅠ酶切之后365bp(可能代表的微生物為Azorhizobium caulinodans (D11342))、396bp(可能代表的微生物為Rhizobium; Sinorhizobium)、400bp(可能代表的微生物為Rhizobium; Sinorhizobium)、455bp(可能代表的微生物為Azotobacter)也分布集中在AN、TN或OM周圍,由此可見土壤細菌群落與土壤氮素含量存在較好的相關性。

表2　土壤化學性質

圖4　消落帶土壤細菌群落HhaⅠ酶切(a)與MspⅠ酶切(b)的CCA分析Fig.4　Canonical correspondence analysis of soil bacterial communities by HhaI (a) and MspⅠ(b)

3討論

微生物群落能夠直接作用于植物根系,可以通過腐殖質分解來改變土壤養分的礦化速率及其空間分布,影響土壤理化性質,改變植物根際的激素狀況,從而間接地影響植物生長發育、調控群落結構[32-33],因此對土壤微生物群落進行調查,可為評估地表植被的生長狀況以及土壤的退化程度提供量化指標[34-35]。

3.1三峽水庫消落帶土壤細菌群落多樣性指數重復度量方差分析

微生物群落多樣性指數是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標,其變化能準確反映群落功能多樣性總體的動態變化,但采用的多樣性指數不同,研究結果也存在較大差異。其中物種豐度指數越大,群落物種豐度越高；Shannon指數用于評估微生物的豐富度和均度,物種越多,分布越均勻,其值越大；Simpson指數用于評估最常見種的優勢度,辛普森指數越大,生物多樣性越高；均勻度指數反映的是各物種個體數目分配的均勻程度。

HhaⅠ酶切結果中,物種因素對消落帶土壤細菌Shannon-Wiener指數(H)、時間因素對土壤細菌Simpson指數(D)無顯著影響(P>0.05,表1),說明HhaⅠ酶切后,牛鞭草與狗牙根兩種植被類型下土壤細菌豐度與均勻度無顯著差異,同時土壤中常見細菌種類的優勢度不隨時間發生顯著改變；除上述結果外,物種、取樣時間、以及兩者的交互作用均對三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性指數產生顯著(P<0.05,表1)或極顯著(P<0.01,表1)影響,可能是由于人工植被栽植之后,土壤固持水土能力增加,維持了土壤團聚體結構,進而影響到土壤細菌群落結構及生物量,增強了細菌群落多樣性[36]。尤其是狗牙根與牛鞭草地上部分生長量大,可以為細菌生長提供大量凋落物；同時,兩種植物其匍匐生長、根系發達,于庫區土壤表層密集生長,植被凋落物和死亡的根等為土壤中的細菌提供了能量來源,均會對細菌多樣性指數產生重要影響[37]。

3.2土壤細菌群落多樣性指數

微生物群落多樣性指數是反映物種豐富度、優勢度以及均勻度的綜合指標,多樣性指數的變化可以反映群落功能多樣性的動態變化[38]。HhaⅠ酶切后人工植被土壤細菌群落豐度顯著高于裸地土壤,牛鞭草與狗牙根的土壤細菌群落豐度與裸地相比,分別增加62%和40%,這可能歸結于人工栽植牛鞭草與狗牙根之后,其根系向周圍環境釋放出各類有機、無機物質,這些分泌物為細菌提供重要的能量物質,促進細菌群落繁殖[39-40],增加了群落多樣性；此外,根系分泌物還可以通過改變土壤pH值、氧化還原電位等間接影響微生物群落多樣性[41]。

有研究表明,根際是植物與土壤接觸的重要界面,植物根系可以釋放不同的分泌物,促進根系形成穩定而獨特的微生物區系[42]。因此,人工栽植牛鞭草與狗牙根之后土壤細菌群落多樣性指數在三次取樣時無顯著改變,而裸地土壤豐度、香農指數、均勻度指數在不同取樣時間內存在顯著差異,其原因可能是由于人工植被栽種之后,狗牙根與牛鞭草特異的根系分泌物促使土壤中形成了穩定的細菌群落區系,而裸地土壤由于無地表植被固持水土,因此土壤及土壤中的細菌均易隨水分的漲落流動而發生遷移,從而造成裸地土壤細菌群落多樣性變化較大。有學者采用PCR-RFLP技術研究土壤及上層植被與土壤微生物多樣性的關系,驗證了植物的分泌物可使得微生物獲得更豐富的資源,同時植被覆蓋保持土壤濕度更適于細菌群落的發展[43],與本研究結果一致。此外,就人工植被土壤而言,栽植牛鞭草和狗牙根之后,實生土壤細菌群落多樣性指數均未發生顯著改變,從一個方面可以說明,在三峽庫區消落帶進行人工植被修復之后,土壤細菌群落多樣性指數更加穩定。

3.3土壤細菌群落優勢種群相對豐度

消落帶土壤中的細菌群落是一個不斷變化的群體,其種群的數量、種類、分布等特征均會受到外界環境條件(如土壤水熱狀況、肥力條件以及植被類型)的影響,因此導致所得到的T-RFLP圖譜有所差別[44-46]。在三峽庫區消落帶特殊的水文條件下,長時間水淹將導致土壤溶氧量減少,勢必對土壤中的需氧、厭氧菌造成影響,同時水文條件可以通過影響土壤有機質以及氮磷含量改變細菌群落結構；此外,植被類型也是土壤細菌群落結構的主要影響因素之一。

細菌群落相對豐度的變化可以歸結于土壤通氣狀況的改變,Bossio認為[47],土壤通氣狀況是影響細菌生命活動的因素之一。三峽水庫冬蓄夏排,使庫區消落帶土壤長時間處于水淹狀態,導致土壤通氣性變差,成為土壤細菌生長的限制因子。研究結果表明,無論是HhaⅠ還是MspⅠ酶切片段,土壤中消失或減少的優勢種屬多為需氧生長型,在三次取樣時其相對豐度持續降低或消失,由此推斷可能是由于長期水淹造成厭氧環境,限制了細菌群落生長繁殖；但部分需氧生長的菌類在不同取樣時間內相對豐度并未持續下降,而呈現下降后升高的趨勢,可見,在外界環境不適時,細菌群落能夠自發的調整其結構以適應外部環境的改變,從而保持長期健康的群落結構；少量厭氧生長菌類的消失可能是由于水分條件影響植被生長狀態、土壤氧化還原電位及養分含量,間接對細菌生長造成影響；土壤養分含量以及細菌個體均可能隨水分漲落在土壤孔隙間發生遷移,可能也是影響細菌群落在土壤中分布的原因之一。

植被對土壤細菌群落的影響,則可能是通過根系特定的分泌物選擇根際周圍的微生物而實現[42]。研究發現,不同植被處理組細菌數量與類型均存在差異,這可能是由于根系分泌物的差異改變土壤細菌群落結構與功能,尤其是牛鞭草與狗牙根根系分泌物的組成、性質與凋落物存在差別,影響了細菌的生長代謝,使土壤中產生不同的細菌群落[48- 49]。

3.4消落帶細菌群落與土壤養分的關系

三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性是其環境因子的反映,植被多樣性與微生物多樣性關系密切,植物可以通過影響土壤的含水量、pH值、有機質含量及氮磷比等,間接作用于細菌群落,從而對細菌群落多樣性產生效應[50]。根據T-RFLP結果,進行土壤化學性質與土壤細菌群落相關性的典范對應分析(CCA)可知：較大T-RFs主要集中AN、TN、TP周圍,OM周圍也有分布。較大片段可能為土壤中藻類(如Algicola、Rhodobacter、piroplasma、Microcystis等),由此可見水淹之后仍然有部分藻類存留在消落帶土壤中,而藻類的過量繁殖是造成水華的主要原因[51],如微胞藻(464bp、469bp)可引起水體的富營養化[52],且分布在TN周圍,這與研究發現的土壤N、P含量呈現升高趨勢相一致。此外,根系分泌的有機酸可以提高難溶性磷的溶解性[53],為土壤細菌提供能源,從而維持旺盛的細菌群落活性,而細菌活性的增加又促進了磷的活化[54],也可能是磷含量增加的原因之一。

土壤細菌群落多樣性與覆蓋于土壤上的植物群落多樣性及生產力相關。牛鞭草與狗牙根栽植之后,植被覆蓋將改變土壤的水熱狀況,自身生長發育會使土壤物理環境得到改善,有利于土壤細菌生長[43],導致一些參與土壤營養循環、改善土壤質地及防治植物病害的有益菌和功能菌迅速繁殖占據主導地位,成為三峽庫區消落帶優勢菌群[55]。HhaⅠ酶切產生的147bp、180bp、181bp、182bp,MspⅠ酶切產生的90bp、110bp、118bp、161bp、455bp、464bp可能代表Bacillus芽孢桿菌,是土壤中的一種優勢菌,對外界有害因子抵抗力強,分布廣泛；Pseudomonas(假單胞菌)是土壤中常見的生防菌,也是三峽庫區消落帶的優勢菌屬,嚴格好氧,消落帶土壤中假單胞菌的存在可以增加牛鞭草、狗牙根的抗性,并可以通過產生代謝物抑制有害微生物、幫助植被吸收養分[56]；土壤中的有機氮很難直接被植物吸收利用,在適宜條件下,經微生物固定[57-58]、反硝化作用[59]、細菌分解等成為植物可利用態,本研究中土壤中Rhizobium根瘤菌屬(HhaⅠ酶切產生的304bp、335bp,MspⅠ酶切產生365bp、396bp、400bp)、Azotobacter固氮菌(MspⅠ酶切產生112bp、455bp)均可固定空氣中的氮氣,為植物共生體及土壤提供氮源。由圖4可知,除365bp分布在OM周圍、112bp分布于TK周圍外,可固氮的菌屬均在TN、AN周圍分布,可見上述細菌群落可能在土壤中以腐生菌狀態存在,為植物生長提供氮素,這與土壤中TN含量增加、AN含量減少相一致。

此外,一些用于碳素循環、氮素循環及分解作用等不同功能的細菌也在消落帶土壤中發現,如降解纖維素的Cellvibrio纖維弧菌(HhaⅠ酶330bp,MspⅠ酶切449bp、455bp)屬和Aeromonas氣單胞菌屬(HhaⅠ酶182bp,MspⅠ酶90bp),聚磷、固氮作用的Arthrobacter節桿菌屬(HhaⅠ酶473bp,MspⅠ酶455bp),能夠改良土壤質地、作為植物病害重要的生防因子之一的Streptomyces鏈霉菌(HhaⅠ酶173bp、473bp,MspⅠ酶切455bp)屬等[60]。有研究證實,綠硫細菌(MspⅠ酶切產生的449bp、455bp、469bp)中的某些菌株具有酶促還原大氣氮為氨的能力。

4結論

不同的環境條件,諸如植被、土壤養分等均會對細菌群落多樣性造成影響。在三峽庫區消落帶特定的水文條件下,與裸地土壤相比,HhaⅠ酶切后人工栽植牛鞭草與狗牙根的土壤細菌群落豐度顯著增加,增加比例分別為62%和40%,且人工植物土壤細菌群落多樣性指數與裸地相比也更加穩定；同時,CCA分析結果表明三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性與化學性質關系密切,較大片段在消落帶中存留可能引起土壤氮磷含量升高,而固氮菌與氮元素的緊密相關性,可能也是土壤全氮含量升高的誘因之一。

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收稿日期:2015- 06- 18;

修訂日期:2015- 11- 30

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: lichangx@swu.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201506181232

Evaluationofbacterialdiversityunderdifferentherbvegetationtypesinthehydro-fluctuationzoneoftheThreeGorgesReservoirinChina

RENQingshui,MAPeng,LIChangxiao*,QINHong,YANGYujing

Key Laboratory for the Eco-Environment of the Three Gorges Reservoir Region of the Ministry of Education, school of Life Sciences,Southwest University, Chongqing 400715, China

Abstract：To better understand the growth condition of vegetation, our study was conducted to explore the dynamics of the soil bacterial community in the hydro-fluctuating zone of the Three Gorges Reservoir (TGR) region in China. In July (2012, 2013, and 2014). We collected and compared soil samples from under two plant species (Hemarthria compressa and Cynodon dactylon) and bare soil. We characterized bacterial community diversity using the terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) molecular method, and also investigated soil chemical properties. Our results show that (1) bacterial diversity was significantly influenced by plant species, time, and their interaction, regardless of which enzyme was used for digestion (HhaⅠ or MspI); however, species for the Shannon-Wiener index (H) and time for the Simpson index (D) when digested by HhaⅠ did not significantly influence bacterial diversity. (2) The richness index (S) of the planted vegetation was significantly higher than in bare areas. In addition, the S, H, D, and evenness (E) indices were more stable for bacterial communities under planted vegetation than bare areas. (3) Vegetation and sampling times influenced the types and relative abundance of predominant terminal restricted fragments in our study. (4) CCA (canonical correspondence analysis) analysis showed that long fragments were more concentrated, especially around nitrogen and phosphorus, and soil bacterial diversity had a close relationship with chemical properties, such as nitrogen, phosphorus and organic matter. In conclusion, two different enzymes were used to explore the diversity of the soil bacterial community in the TGR region, and their digestion maps, analyzed by synthesis, illustrate that our analysis results are objective. Furthermore, the results indicate that vegetation type and soil chemical properties affect diversity in the soil bacterial community. However, in the fluctuation zone of the TGR, the bacterial diversity indices became more stable after revegetation, which confirms that planted revegetation can improve soil bacterial diversity; in addition, bacterial diversity was affected by soil chemical properties (N, P, OM).

Key Words:T-RFLP; the Three Gorges Reservoir Area; hydro-fluctuation zone; revegetation; bacterial community diversity

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