Allicin對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用及可能機制

陳　晶　李巧霞　李　瑋　李　宏　湯　菲　王縛鯤

(中國人民解放軍白求恩國際和平醫院檢驗實驗科,石家莊050082)

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Allicin對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用及可能機制

陳晶李巧霞①李瑋李宏①湯菲王縛鯤

(中國人民解放軍白求恩國際和平醫院檢驗實驗科,石家莊050082)

[摘要]目的：明確Allicin對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用并進一步分析可能的機制。方法：將24只8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為3組：Control組：陰性對照；DSS組：2.5%DSS誘導結腸炎；Allicin組：2.5%DSS誘導結腸炎+Allicin治療[10 mg/(kg·d),共7 d]。結果：與DSS組比較，Allicin組疾病活動度評分及腸道炎癥評分顯著降低(P<0.05)。Allicin治療組小鼠腸上皮細胞凋亡數目顯著低于DSS組。Allicin治療組小鼠腸黏膜炎癥因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)水平顯著低于DSS組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。與DSS組比較，Allicin治療顯著抑制了腸黏膜p-JAK2及p-STAT3的表達(P<0.05)。結論：Allicin對DSS小鼠腸炎具有治療作用，可能的機制包括抗炎，保護腸上皮細胞及抑制JAK2/STAT3信號通路等。

[關鍵詞]Allicin；動物模型；潰瘍性結腸炎；凋亡；炎癥

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的炎癥性腸病，病變可累及全結直腸。該病病程表現為復發與緩解相交替，無法治愈，患者有終身復發傾向。目前UC的發病機制并不清楚，但認為與遺傳易感、腸道菌群及黏膜免疫異常等因素有關[1]。目前的藥物治療效果并不理想，且多數藥物具有較為明顯的毒副作用[2]。開發新藥物有利于提高該病的治療水平。在基礎研究中常采用葡聚糖硫酸鈉(Dextra sulfate sodium，DSS)建立小鼠結腸炎模型。DSS小鼠結腸炎模型是國際公認的UC動物模型[3]。Allicin是一種大蒜提取物，新近的研究表明Allicin具有抗炎、抗菌及抗腫瘤等多種功能[4,5]。我們嘗試采用Allicin治療DSS小鼠結腸炎，以期為UC的治療尋找可能的新藥物。

1材料與方法

1.1分組及干預將24只雄性BALB/c小鼠[體質量(24.8±2.5)g]飼養于SPF環境下；控制室內溫度在25～27℃；防止噪聲及強光燈干擾；小鼠自由飲水和進食。小鼠長至8周齡[體質量(24.8±2.5)g]時隨機分為Control組、DSS組及Allicin組，每組8只。每組小鼠接受如下干預：Control組：陰性對照；DSS組：采用DSS誘導結腸炎；Allicin組：DSS誘導結腸炎+Allicin(Abcam，USA)治療[10 mg/(kg·d),灌胃給藥，共7 d]。

DSS組及Allicin組建立DSS結腸炎模型的方法依據Cooper等[6]的推薦：采用2.5%DSS(MP Biochemicals,USA)溶液取代實驗小鼠的飲用水，共7天。第8天脫頸處死小鼠，取結腸組織分別儲存于-80℃冰箱及福爾馬林固定。

1.2檢測及評估指標評估小鼠疾病活動情況：實驗期間觀察并記錄小鼠疾病活動相關指標，并評估疾病活動度指數(Disease activity index,DAI)[3]：稀便(1分)、便血(1分)、直腸脫垂(1分)、毛發豎立(1分)，嚴重直腸脫垂及嚴重腹瀉情況各加1分，累計得分為小鼠DAI最終得分。

評估小鼠腸道炎癥：蘇木素伊紅染色后光學顯微鏡下觀察，并計算腸道炎癥評分[7]：共0～4分，分數越高代表腸道炎癥越重。

評估小鼠腸上皮細胞凋亡情況：參照說明書，采用商品化TUNEL試劑盒(Roche,瑞士)檢測腸上皮細胞凋亡。

評估小鼠腸黏膜炎癥因子水平：刮取腸黏膜組織后勻漿，采用商品化ELISA試劑盒(R&D，美國)法檢測白介素10(Interleukin-10，IL-10)、白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)。

評估小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號通路的改變：采用Western blot法檢測p-JAK2及p-STAT3，具體操作方法參照文獻[8]，簡述：提取并采用Bradford法定量蛋白，置入5×loading沸水中煮10 min(1∶4比例)，使之變性，每孔加入35 μg蛋白，電泳、轉膜后封閉1 h，加入JAK2、STAT3或β-actin(1∶1 000，R&D公司)一抗，搖床12 h(4℃)，滴加二抗后洗膜，顯影后行灰度值分析(Image J軟件)。

2結果

2.1Allicin對DSS小鼠的治療效果三組小鼠疾病活動度評分見圖1。Allicin治療組小鼠疾病活動度評分顯著低于DSS組小鼠，相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

三組小鼠結腸病理組織學圖片及腸道炎癥評分見圖2。Allicin組小鼠腸道炎癥評分顯著低于DSS，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2Allicin對DSS小鼠腸上皮細胞凋亡的影響如圖3所示，Control組小鼠腸上皮細胞未見明顯凋亡，DSS組小鼠上皮細胞凋亡明顯。Allicin組小鼠腸上皮細胞凋亡數量顯著低于DSS組小鼠，相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3Allicin對DSS小鼠腸黏膜炎癥因子水平的影響三組小鼠腸黏膜炎癥因子水平見圖4。三組腸黏膜IL-10水平相比較差異均無統計學意義(P>0.05)。Allicin組小鼠腸黏膜IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著低于DSS組小鼠，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.4Allicin對DSS小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號通路的影響圖5顯示，Allicin治療組小鼠腸黏膜p-JAK2及p-STAT3水平，相比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖1　小鼠疾病活動度評分比較Fig.1　Compare of disease activity index among three groupsNote: *.P<0.05.

圖2　小鼠腸道炎癥評分比較Fig.2　Compare of inflammatory scores among three groupsNote: *.P<0.05.

圖3　小鼠腸上皮細胞凋亡情況比較Fig.3　Compare of intestinal epithelial cell apoptosis among three groupsNote: *.P<0.05.

圖4　小鼠腸黏膜炎癥因子水平的比較Fig.4　Compare of intestinal mucosa inflammation factors among three groupsNote: *.P<0.05.

圖5　Allicin對DSS小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號通路的影響Fig.5　Impact of Allicin on JAK2/STAT3 signal pathway in intestinal mucosaNote: *.P<0.05.

3討論

UC的治療是一個世界性難題，病情反復且不可治愈，部分患者可并發惡性腫瘤[9]。隨著我國UC的發病率不斷升高也引起了胃腸科醫生的高度重視。雖然可以通過手術切除全結腸以徹底治療該病，但這種致殘性手術會顯著影響患者的生活質量。且多數患者疾病癥狀并不重，可通過藥物延緩疾病進展。但目前臨床多采用免疫抑制劑治療UC，其副作用較大，患者往往難以接受。Allicin是一種百合科植物提取物，屬于三硫代烯丙醚類化合物[10]。目前的研究表明Allicin的藥用價值極高，可能在自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥、感染性疾病等的治療中具有應用價值[11,12]。

我們的研究顯示，經過2周Allicin治療后，Allicin組小鼠疾病活動度評分顯著降低，病理學證實小鼠腸道炎癥顯著改善。這提示Allicin對DSS小鼠具有確定的治療作用。腸上皮細胞凋亡是腸屏障破壞的重要表現形式，而腸屏障功能受損是UC的主要發病機制之一[13,14]。因而我們采用TUNEL法檢測了小鼠腸上皮細胞凋亡情況，結果發現Allicin可顯著改善由DSS引發的腸上皮細胞凋亡。這可能與Allicin的抗炎作用有關，因而我們檢測了小鼠腸黏膜炎癥因子的表達，結果發現Allicin顯著降低了包括IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。這提示Allicin在體可發揮抗炎功能。JAK2/STAT3信號通路參與炎癥級聯放大過程，且可被IL-6激活[15]。因而，我們分析并發現Allicin可抑制JAK2/STAT3信號通路。這可能是Allicin發揮抗炎作用的另一機制，但仍需進一步研究以明確。

綜上所述，我們的研究證實Allicin對DSS小鼠腸炎具有治療作用，可能的機制包括抗炎、抑制上皮凋亡及抑制JAK2/STAT3信號通路等。

參考文獻：

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[收稿2016-01-06修回2016-03-07]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.024

作者簡介：陳晶(1970年-)，女，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗診斷學及生物技術方面研究。

通訊作者及指導教師：王縛鯤(1970年-)，男，主任醫師，主要從事感染免疫方面研究。

中圖分類號R574.6

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1039-04

Therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms

CHEN Jing,LI Qiao-Xia,LI Wei,LI Hong,TANG Fei,WANG Fu-Kun.Department of Clinical Laboratory,Bethune International Peace Hospital of PLA,Shijiazhuang 050082,China

[Abstract]Objective:To analyze the therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms.Methods: A total of 24 male mice were randomly divided into Control group,DSS group(2.5% DSS,7 days) and Allicin group [DSS treatment and Allicin，10 mg/(kg·d),7 d].Disease activity index,inflammatory score,TUNEL and Western bolt were performed to analyze the effect of Allicin on colitis induced by DSS.Results: With DSS group,the Allicin group had lower disease activity score and inflammatory score(P<0.05).Allicin group had a lower number of intestinal epithelial cell apoptosis than that of DSS group,the difference was statistically significant(P<0.05).Western bolt analysis shown that Allicin treatment significantly depressed the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in intestinal mucosa when compared with these of DSS group(P<0.05).Conclusion: Conclusion Allicin has significantly therapeutic effect on mice colitis induced by DSS,the possible mechanisms including anti-inflammatory effects,protected of the intestinal epithelial cells and inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathways.

[Key words]Allicin；Animal model；Ulcerative colitis；Apoptosis；Inflammation

①河北醫科大學第四醫院，石家莊050011。