miR-126在乳腺癌中與VEGF表達關系及其抗腫瘤效果①

米旭光　李首慶　劉　多　魏海峰　江顯卓　方艷秋

(吉林省人民醫院腫瘤綜合治療科，長春130021)

?

miR-126在乳腺癌中與VEGF表達關系及其抗腫瘤效果①

米旭光李首慶劉多魏海峰江顯卓方艷秋

(吉林省人民醫院腫瘤綜合治療科，長春130021)

[摘要]目的：探討miR-126與VEGF在乳腺癌中的表達情況，及miR-126發揮的抗腫瘤效果。 方法：以qRT-PCR檢測和Western blot分析miR-126與VEGF在乳腺癌組織和細胞中的表達情況；以miR-126 mimics轉染乳腺癌細胞株MDA-MB-231，檢測miR-126對VEGF的表達影響，MTT法和細胞劃痕實驗驗證miR-126對腫瘤細胞的增殖和遷移能力的影響。 結果：miR-126在乳腺癌組織和細胞中呈低表達，VEGF表達與其呈負相關，上調miR-126可以降低VEGF的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。 結論：miR-126可以通過下調VEGF表達來實現降低乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，從而發揮抗腫瘤效果。

[關鍵詞]miR-126；VEGF；乳腺癌

乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，是第六大中國女性癌癥的死亡原因。尋找特異性的治療靶點和有效的治療方法一直是克服乳腺癌的研究方向。microRNA是長約22個核苷酸的非編碼RNA，可以使靶基因mRNA降解或抑制其翻譯來影響靶基因的表達，參與腫瘤細胞的分化、增殖和凋亡，與腫瘤的發生、發展、轉移、侵襲、復發和預后都有著重要的關系[1]。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促進腫瘤血管生成，增強乳腺癌細胞的增殖、轉移和復發[2]。VEGF受到多種microRNA的直接或間接調控，調節某些特異性的microRNA的表達可能成為抗VEGF治療腫瘤的新手段。抑癌基因miR-126被證實與乳腺癌腫瘤血管形成密切相關，本研究將探討miR-126在乳腺癌細胞中對VEGF基因表達的影響及由此發揮的抗腫瘤效果。

1材料與方法

1.1細胞株與試劑人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1為本實驗室凍存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培養基(Gibco，美國)；Trizol 、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美國)；Has-miR-126 mimics及陰性對照Cel-miR-67 mimics(上海百奧邁科，中國)；miR-126、U6、VEGF和GAPDH引物(上海生工，中國)；RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)；鼠抗人VEGFA抗體(Abcam，美國)；馬抗鼠IgG(CST，美國)；GAPDH抗體(Santa，美國)；其他常規試劑產自北京化工。

1.2標本采集留取2013年3月至2014年3月吉林省人民醫院乳腺癌手術標本5例，包括癌組織5例和正常組織塊2例(距離癌灶>3 cm且病理證實無癌細胞殘留)。組織樣本取出后剪碎盡快放入液氮速凍，之后放入-80℃冰箱凍存。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養和脂質體轉染乳腺癌細胞株MDA-MB-231使用含10% FBS，100 μg/ml鏈霉素及100 U/ml青霉素的DMEM(高糖)培養基培養；CAL-120細胞使用含20%FBS的雙抗DMEM培養基；MCF-7、HCC1806、JIMT-1細胞株使用含雙抗的RPMI medium 1640培養基。細胞培養條件為37℃，5% CO2和100%飽和濕度的細胞培養箱。用于轉染的細胞，在轉染前1 d細胞生長豐度達到70%～80%時，胰酶消化轉至細胞培養板中，以2×105個/孔接種細胞(以MDA-MB-231細胞，6孔細胞培養板為例)。轉染當天細胞豐度可達60%～70%。每孔轉染miR-126 mimics 5 μl(終濃度為50 nmol/L)，具體操作步驟如LipofectamineTM2000說明書。轉染后48 h，提取RNA或蛋白用于后續實驗。

1.3.2總RNA提取和qRT-PCR檢測用Trizol法提取乳腺癌組織、癌旁正常組織和乳腺癌細胞株總RNA。紫外分光光度計測量純度和濃度。按逆轉錄說明書將1 μg RNA逆轉錄為cDNA。得到的cDNA 5倍稀釋用于熒光定量反應。使用2×SYBR Green Master在ABI7500熒光定量PCR儀上測定。miR-126表達以U6作為內參，VEGF表達以GAPDH為內參。結果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數比值。

Hsa-miR-126:頸環引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′；miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′；miRNA Universal reverse primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′；VEGF forward primer:5′-CGAAG TGGTG AAGTT CATGG-3′,reverse primer:5′-GTACT CGATC TCATC AGGGT-3′；GAPDH forward primer:5′-CAATG ACCCC TTCAT TGACC-3′，reverse primer:5′-GACAA GCTTC CCGTT CTCAG-3′。

1.3.3蛋白樣本制備和免疫印跡分析取100 mg組織標本加入500 μl組織蛋白裂解液勻漿后，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。乳腺癌細胞每孔加入80 μl細胞裂解液重懸細胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，離心取上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉膜，封閉液中封閉2 h，VEGF和GAPDH一抗4℃過夜，酶標二抗室溫2 h，顯色，拍照。

1.3.4細胞增殖實驗(MTT法)將處于生長對數期的乳腺癌細胞株MDA-MB-231以7.5×103個/孔的密度接種于96孔細胞培養板中。次日，板中待轉染細胞豐度達50%～60%，轉染miR-126 mimics 及陰性對照(NC)，每孔0.25 μl(終濃度為50 nmol/L)，設5復孔。轉染5 h后換完全培養液，分別于轉染換液后0、24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養4 h后，移除培養液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標儀中檢測轉染組與對照組波長490nm處的光吸收值。

1.3.5細胞劃痕實驗6孔板培養MDA-MB-231細胞，次日細胞豐度達60%～70%時轉染miR-126 mimics 及陰性對照(NC)，每孔5 μl(終濃度為50 nmol/L)，轉染5 h后細胞培養孔以細槍頭十字劃痕，輕晃培養板，換液后拍攝轉染0 h細胞劃痕圖像，24 h、48 h后同樣拍攝。

2結果

2.1miR-126在乳腺癌組織和細胞中的表達2例正常乳腺組織和5例乳腺癌組織提取RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測miR-126在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達情況(U6作為內參)。如圖1A，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織miR-126表達明顯降低(P<0.05)。

圖1　miR-126在乳腺癌組織和細胞中的表達差異Fig.1　Expression of miR-126 in breast cancer tissues and cellsNote: A.qRT-PCR analysis of miR-126 expression in five human breast cancer tissues(T1-T5) vs.the distant non-tumor tissues(N1-N2)；B.qRT-PCR analysis of miR-126 expression in five human breast cancer cell lines.

乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1分別提取RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測miR-126在乳腺癌細胞中的表達情況。以表達miR-126最高的HCC1806細胞株為參照，各細胞株miR-126的相對表達情況如圖1B。

2.2乳腺癌細胞中VEGF的表達乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1分別提取RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測VEGF在乳腺癌細胞中的mRNA表達水平。以表達VEGF最高的MDA-MB-231細胞株為參照，各細胞株VEGF表達情況如圖2。

結果顯示，在幾種乳腺癌細胞株中， VEGF mRNA 的表達與miR-126呈負相關。其中，miR-126表達最高的HCC1806細胞株，VEGF mRNA 表達水平最低；而miR-126表達最低的高侵襲性的MDA-MB-231細胞株，VEGF mRNA 表達水平最高。

圖2　VEGF在乳腺癌細胞中的表達差異Fig.2　Expression of VEGF in breast cancer cells

圖3　miR-126對MDA-MB-231細胞株中VEGF表達影響Fig.3　Effect of miR-126 on VEGF in MDA-MB-231 cellsNote: A.miR-126 expression after miR-126 mimics transfected;B.VEGF mRNA expression after miR-126 mimics transfected;C.VEGF protein expression after miR-126 mimics transfected.

2.3miR-126對VEGF表達的影響miR-126 mimics 50nm轉染MDA-MB-231細胞株48 h后，提取細胞RNA和細胞蛋白，進行qRT-PCR檢測和Western blot分析。結果顯示，miR-126 mimics轉染后，miR-126表達顯著升高(P<0.01)(圖3A)，而VEGF mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)(圖3B)。蛋白印跡分析顯示，miR-126表達升高的情況下，VEGF蛋白表達明顯下降(圖3C)。

2.4miR-126對乳腺癌細胞增殖能力的影響MTT增殖實驗結果顯示，MDA-MB-231細胞轉染miR-126 mimics 50nm 48 h后，細胞增殖能力明顯低于對照(NC)組(P<0.05)，轉染72 h差別顯著(P<0.01)(圖4)。VEGF可以促進腫瘤細胞的增殖，miR-126表達增高時VEGF表達下調，細胞增殖能力下降。

2.5miR-126對乳腺癌細胞遷移能力的影響劃痕實驗結果顯示，MDA-MB-231細胞轉染miR-126 mimics 50nm 24 h后，細胞遷移能力明顯低于對照(NC)組(P<0.05)，轉染48 h差別顯著(P<0.01)(圖5)。VEGF可以增強腫瘤細胞的轉移能力，miR-126表達增高時VEGF表達下調，細胞遷移能力下降。

圖4　miR-126對MDA-MB-231細胞增殖影響Fig.4　Effect of miR-126 on MDA-MB-231 cell proliferation

圖5　miR-126對MDA-MB-231細胞遷移能力影響Fig.5　Effect of miR-126 on MDA-MB-231 cell migration

3討論

miRNA在腫瘤的發生發展中起到癌基因或抑癌基因的作用[3，4]。有抑癌基因作用的miR-126在大部分腫瘤組織中呈低表達，腫瘤的發生、發展與其表達的降低和缺失相關，其在腫瘤的診斷、治療及預后判斷等方面均具有潛在價值。研究發現[5-13]，miR-126 可抑制結腸癌細胞生長；抑制非小細胞肺癌細胞的增殖；抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移；且其表達水平與肝癌復發后生存率呈正相關； miR-126 是乳腺癌轉移的抑制因子，可抑制乳腺癌細胞的細胞周期進程，其缺失易導致預后不良和腫瘤復發。由此說明，miR-126在多種腫瘤中發揮著抑癌作用，miR-126表達增高可以抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，降低復發率和提高生存率。

本研究中顯示，乳腺癌組織中miR-126的表達明顯低于正常乳腺組織的表達(P<0.05)，與同類研究結果相同。在本研究中不同侵襲力的乳腺癌細胞株miR-126的表達也顯示出差異，即侵襲力強的乳腺癌細胞株miR-126表達明顯降低，如MDA-MB-231細胞株。侵襲和轉移能力是衡量腫瘤惡性程度的一個重要標準，所以與乳腺癌轉移相關的miRNA也得到重視。本文研究的miR-126可以抑制腫瘤細胞生長和侵襲，但其作用的靶點和機制在現有研究基礎上仍需要深入研究。

腫瘤血管的形成是腫瘤可以生長、侵襲和轉移的必備條件之一，VEGF是腫瘤血管生成過程中作用最強、特異性最高的促血管生長因子，在肺癌、宮頸癌等多種人類惡性腫瘤中都有較高水平的表達。Liu等[14]發現編碼VEGF-A mRNA3′的非編碼區有miR-126 的結合位點，本研究顯示，miR-126表達最高的HCC1806細胞株，其VEGF mRNA的表達也是最低的。且在人為的調高MDA-MB-231細胞株中miR-126表達后，VEGF mRNA和蛋白水平上的表達均降低，且乳腺癌細胞的增殖和侵襲水平也明顯降低。我們由此推論，轉染miR-126模擬物使乳腺癌細胞中miR-126表達上調，使得VEGF表達水平明顯降低，miR-126抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的作用可能是通過下調VEGF表達來實現的。

綜上所述，miR-126可作為乳腺癌的一個重要抑癌基因，其表達上調可使增強腫瘤微血管形成相關的VEGF基因表達降低，進而發揮抑制乳腺癌發展和轉移的功能，即miR-126可成為乳腺癌診斷、治療及復發預后等的重要參考指標。

參考文獻：

[1]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions [J].Cell,2009,136(2):215-233.

[2]Luo HQ,Xu M,Zhong WT,etal.EGCG decreases the expression of HIF-1α and VEGF and cell growth in MCF-7 breast cancer cells[J].J BUON，2014,19(2):435-439.

[3]Li H,Yang BB.MicroRNA-regulated stress response in cancer and its clinical implications[J].Cell Cycle，2013,12(13):1983-1984.

[4]Vrba L,Jensen TJ,Garbe JC,etal.Role for DNA methylation in the regulation of miR-200c and miR-141 expression in normal and cancer cells[J].PLoS One,2010,5(1):e8697.

[5]Ahmed FE,Jeffries CD,Vos PW，etal.Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue[J].Cancer Genomics Proteomics,2009,6(5):281-295.

[6]Guo C,Sah JF,Beard L,etal.The noncoding RNA,miR-126,suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers [J].Genes Chromosomes Cancer,2008,47(11):939-946.

[7]Sun Y,Bai Y,Zhang F,etal.miR-126 inhibits non-small cell lung cancer cells proliferation by targeting EGFL7[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391(3):1483-1489.

[8]Hansen TF,Srensen FB,Lindebjerg J,etal.The predictive valuer of microRNA-126 in relation to first line treatment with capecitabine and oxaliplatin in patients with metastatic colorectal cancer[J].BMC Cancer,2012,12：83.

[9]Yang Z,Wang R,Zhang T,etal.MicroRNA-126 regulates migration and invasion of gastric cancer by targeting CADM1[J].Int J Clin Exp Pathol，2015 ,8(8):8869-8880.

[10]Han ZB,Zhong L,Teng MJ,etal.Identification of recurrence-related microRNAs in hepatocellular carcinoma following liver transplantation[J].Mol Oncol,2012,6(4):445-457.

[11]Yin J,Bai Z,Song J,etal.Differential expression of serum miR-126,miR-141 and miR-21 as novel biomarkers for early detection of liver metastasis in colorectal cancer[J].Chin J Cancer Res，2014,26(1):95-103.

[12]Tavazoie SF,Alarcón C,Oskarsson T,etal.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature,2008，451(7175):147-152.

[13]Wang CZ,Yuan P,Li Y.MiR-126 regulated breast cancer cell invasion by targeting ADAM9.[J].Int J Clin Exp Pathol，2015,8(6):6547-6553.

[14]Liu B,Peng XC,Zheng XL,etal.MiR-126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo[J].Lung Cancer,2009,66(2):169-175.

[收稿2015-11-09修回2015-11-30]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.015

作者簡介：米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療研究，E-mail:mixg699@163.com。 通訊作者及指導教師：方艷秋(1968年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤綜合治療的科研及臨床工作，E-mail:yq.fang@163.com。

中圖分類號R735.7

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1000-04

MiR-126 expression relationship with VEGF in breast cancer and its anti-tumor effect

MI Xu-Guang,LI Shou-Qing,LIU Duo,WEI Hai-Feng，JIANG Xian-Zhuo,FANG Yan-Qiu.

Tumor Comprehensive Treatment Department,Jilin Province People′s Hospital,Changchun 130021,China

[Abstract]Objective:To probe the expression of miR-126 and VEGF in breast cancer,and the anti-tumor effect of miR-126.Methods: The expression of miR-126 and VEGF in breast cancer tissues and cells were detected by qRT-PCR and Western blot;after transfection with miR-126 mimics into MDA-MB-231,expression of VEGF was detected again,MTT assay and cell scratch test were used to verify the influence of miR-126 on proliferation and migration of tumor cells.Results: The expression of miR-126 was lower in the breast cancer tissues and cells,the expression of VEGF was negative correlation with it,increasing the expression of miR-126 may decrease the expression of VEGF and inhibit the proliferation and migration of breast cancer cells.Conclusion: miR-126 can reduce the proliferation and migration of breast cancer cells by inhibiting the expression of VEGF,which play an anti-tumor effect.

[Key words]miR-126; VEGF;Breast cancer

①本文由吉林省衛生廳科技計劃項目(No.2012Z080；2014Z012)、長春市社會發展科技計劃項目(No.2012129-12SF57)和吉林省科技發展計劃項目(No.20140519018JH；20122113)資助。