實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用效果觀察

姚秀林（遼寧省撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 撫順 113006）

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實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用效果觀察

姚秀林
（遼寧省撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 撫順 113006）

【摘要】目的 分析研究實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和細(xì)胞培養(yǎng)法兩種檢測(cè)方法在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用、及適合的領(lǐng)域。方法 采集2014年10月至2015年3月國(guó)家級(jí)流感檢測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院撫順市中心醫(yī)院內(nèi)科和兒科門診病例咽拭子樣本500份，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)流感病毒核酸，以及采用MDCK進(jìn)行陽性標(biāo)本培養(yǎng)，分離流感病毒，比較兩種方法的靈敏度以及差異性。結(jié)果 在500份樣本中，通過熒光RT-PCR檢測(cè)陽性84份；通過MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法陽性35份。二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 實(shí)施熒光RT-PCR在檢測(cè)流感病毒時(shí)快速有效，更適合應(yīng)急疫情的快速診斷。細(xì)胞培養(yǎng)法更適合核實(shí)疫情的實(shí)驗(yàn)室診斷，通過病毒抗原性和基因特性進(jìn)行分析，是流感病原學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；細(xì)胞培養(yǎng)法；病毒核酸；MDCK

流感病毒可引起急性呼吸道疾病，具有傳染性，俗稱流行性感冒。目前流感已經(jīng)做到了全球監(jiān)測(cè)，但是卻仍然無法完全控制，所以，有效的鑒定流感病毒，進(jìn)行有效分離是監(jiān)測(cè)和臨床診斷的基礎(chǔ)。本文通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR［1-2］、MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法來對(duì)流感病毒的檢測(cè)分離進(jìn)行分析探討。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源：2014年10月1日至2015年3月31日在國(guó)家級(jí)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院撫順市中心醫(yī)院內(nèi)科和兒科門診就診患者，每周采集20份流感樣病例（體溫≥38 ℃，伴咳嗽或咽痛之一者）咽拭子樣本，置于MEM采樣液中，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。樣本數(shù)量：500份。

1.2器材和試劑：儀器采用采用AB 7500 Fast熒光定量擴(kuò)增儀、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱。試劑來源：PCR試劑：提取試劑為QIAGEN RNeasy Mini Kit，擴(kuò)增試劑為甲、乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光探針PCR法）試劑廠家：江蘇碩世生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：MDCK細(xì)胞由遼寧省疾控中心提供，抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata、Victoria系病毒血清由國(guó)家流感中心提供，MEM、Hank's液、胎牛血清購(gòu)于GIBCO公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法：根據(jù)已采集的咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，并按照試劑盒說明進(jìn)行操作［3］，用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取樣本模板，通過反應(yīng)體系配置，后使用AB 7500 Fast熒光定量擴(kuò)增儀擴(kuò)增。

反應(yīng)條件：50 ℃30 min→95 ℃5 min預(yù)變性→95 ℃10 s變性55 ℃40 s退火、延伸及檢測(cè)熒光45cycle，55 ℃處收集熒光，檢測(cè)通道：FAM。

反應(yīng)體系配置：RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL、酶混合液5 μL、甲型、乙型流感反應(yīng)液4 μL、去RNA酶水3.5 μL、病毒核酸/RNA5 μL，總體積25 μL。

1.3.2MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法。流感病毒MDCK細(xì)胞分離步驟：①用無菌的移液管將清洗細(xì)胞的Hank's液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出；②用無菌的移液管吸取適量臨床標(biāo)本置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動(dòng)數(shù)次；③然后放于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h；④吸出接種物，用Hank's液清洗細(xì)胞2遍；然后加入病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；⑤放置于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；⑥每日觀察細(xì)胞病變情況；⑦當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，將HA≥16的樣本用血凝抑制試驗(yàn)（HI）判定流感病毒亞型［4］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2比較，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1自2014年10月1日起至2015年3月31日，分別通過兩種方法進(jìn)行檢測(cè)比較，500份咽拭子標(biāo)本通過熒光RT-PCT檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出陽性84份；通過MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)，結(jié)果分離出陽性35份。見表1。

2.2通過兩種方法檢測(cè)，綜合500份樣本總體檢測(cè)情況，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽性率為16.80%，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)陽性率較低7.00%，二者之間差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.5804，P＜0.05）。見表2。

3 討 論

通過對(duì)500份咽拭子運(yùn)用兩種方法檢測(cè)，結(jié)果實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)分離效果優(yōu)于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法，陽性率16.80%明顯高于細(xì)胞培養(yǎng)法7.00%。此方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷，通常可適用于流感爆發(fā)初期的大面積快速篩查，能及時(shí)準(zhǔn)確的為流感疫情處置提供有效依據(jù)。細(xì)胞培養(yǎng)法通常用于實(shí)驗(yàn)室診斷，主要針對(duì)流感病原的監(jiān)測(cè)，其對(duì)于深入研究流感病毒的抗原性、耐藥性等方面更為顯著，但是細(xì)胞培養(yǎng)法由于操作較為復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間過長(zhǎng)、需要活體病毒樣本，其對(duì)于標(biāo)本運(yùn)輸采集等環(huán)節(jié)限制比較明顯，要求很高［5］，所以，細(xì)胞培養(yǎng)法針對(duì)流感爆發(fā)時(shí)的檢查以及臨床應(yīng)用上就有很大限制。

表1　2014年10月至2015年3月兩種方法分離流感病毒結(jié)果比較

表2　兩組檢測(cè)結(jié)果陽性率情況統(tǒng)計(jì)

綜上所述，兩種流感病毒的檢測(cè)手段，根據(jù)其不同的特點(diǎn)，在運(yùn)用時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待，在流感爆發(fā)初期，應(yīng)選擇實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，充分運(yùn)用其操作簡(jiǎn)單、及時(shí)的特點(diǎn)，作為一種初選方法，而對(duì)于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)核酸檢測(cè)陽性的標(biāo)本進(jìn)行分離，以此總體提高檢測(cè)效率。

參考文獻(xiàn)

［1］ 王文碧.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法快速檢測(cè)流感病毒的效果分析［J］.醫(yī)藥前沿，2015，5（21）:328.

［2］ 楊露露.實(shí)時(shí)熒光定量 Real-timePCR 和 RT-PCR 技術(shù)在流感疫情檢測(cè)中的作用［J］.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘（電子版），2014，14 （2）:138.

［3］ 陳燁.實(shí)時(shí)熒光PCR用于流感病毒檢測(cè)的效果分析［J］.醫(yī)藥與保健，2014，22（3）:100-100.

［4］ 劉建軍，程小雯，賀連華，等.用雞胚和MDCK細(xì)胞分離流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2002，18（3）:335-336.

［5］ 莫浩聯(lián)，司徒潮滿，侯紅斌，等.流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10（9）:1076-1077.

中圖分類號(hào)：R511.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）04-0047-02