HPLC法測定富馬酸二甲酯中的有關物質

鄧雙炳　石　巖　韓　琳　涂　濤*（.深圳萬和制藥有限公司　深圳　58057；.中國食品藥品檢定研究院　北京　00050；.北京博愛旺康醫藥科技有限公司　北京　0076）

HPLC法測定富馬酸二甲酯中的有關物質

鄧雙炳1石巖2韓琳3涂濤3*（1.深圳萬和制藥有限公司深圳518057；2.中國食品藥品檢定研究院北京100050；3.北京博愛旺康醫藥科技有限公司北京100176）

目的：建立HPLC法測定富馬酸二甲酯中的有關物質。方法：采用C18色譜柱，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為210nm。結果：富馬酸二甲酯、雜質A、雜質B在0.2～2.0μg·mL-1范圍內線性關系良好；雜質A和雜質B的平均回收率分別為98.3%和96.7%，RSD分別為2.3%和2.7%。結論：本方法的專屬性、準確度、靈敏度等符合要求，可用于測定富馬酸二甲酯中的有關物質。

富馬酸二甲酯 有關物質 高效液相色譜 測定

2013年3月，美國Biogen公司把富馬酸二甲酯（1）開發成治療多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）新藥（商品名：Tecfidera）獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，隨后獲得歐洲藥物管理局（EMA）的批準，目前在國內還沒有獲得批準。分析合成工藝路線，它可能存在的有關物質主要有富馬酸即為雜質A（2）、富馬酸單甲酯即為雜質B（3），馬來酸即為雜質C（4）、馬來酸二甲酯即為雜質D（5）。本研究建立HPLC法用于測定1中的有關物質，經方法學驗證，專屬性好、靈敏度高、準確度好。

1儀器與試藥

2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）。1工作對照品（自制，含量99.7%，批號DMF-20140501）；2對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.4%，批號111541-201102）；3工作對照品（自制，含量97.2%，批號DMF-B-20140601）；4對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.7%，批號190015-201302）；5工作對照品（自制，含量98.8%，批號DMF-D-20140601）。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為純化水。

2方法與結果

2.1色譜條件：色譜柱為博納艾杰爾的ASB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為210nm；流速為1mL/min；進樣量10μL。

表1梯度洗脫程序

2.2溶液的配制：供試品溶液：取1原料藥適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，用流動相稀釋制成1mg·mL-1的溶液。對照溶液：取1工作對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，用流動相稀釋制成1μg·mL-1的溶液。系統適用性試驗溶液：取1、2、3、4、5對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成1的濃度約為1mg·mL-1，2、3、4、5的濃度均約為0.02mg·mL-1的混合溶液。

2.3方法學研究

2.3.1系統適用性試驗：取“2.2”項下的系統適用性試驗溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各峰的分離度均不低于1.5（圖1）。

2.3.2專屬性

（1）已知雜質的分離度試驗：同系統適用性試驗。

（2）溶劑干擾試驗：精密量取甲醇10μL注入液相色譜儀，結果無干擾。

（3）粗品：取1粗品10mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后進樣測定，結果顯示僅存在2和3。

（4）降解試驗：取1原料藥10mg，5份，置10mL量瓶中，分別進行高溫、強酸、強堿、氧化、光照的破壞試驗，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別進樣測定，結果表明各破壞條件下的降解產物主要為2、3，其他降解雜質均與1、2、3、4、5分離良好。

綜上，方法的專屬性良好；根據粗品和降解試驗結果，僅對2、3按《中國藥典》［1］要求進行定量的系統方法學研究，而對4、5僅進行限度方法學研究（檢測限、專屬性、耐用性）。

2.3.3檢測限與定量限：精密稱取1、2、3、4、5對照品適量，用甲醇分別制成10μg·mL-1的對照品貯備液；分別用甲醇逐級稀釋，當信噪比約為10時計算為定量限，當信噪比約為3時計算為檢測限。結果顯示最低定量限分別為53.5、34.7、144.5、150.5、45.5ng·mL-1，最低檢測限分別為16.2、10.5、43.8、45.6、13.8ng·mL-1。

2.3.4線性與范圍：精密量取“2.3.3”項下的1、2、3對照品貯備液，用甲醇稀釋成系列濃度（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0μg·mL-1）的溶液，分別進樣測定，以樣品濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。1：A=161473.200C+11.7363，r=0.9998；2：A=16997.402C+35.0756，r=0.9992；3：A=57669.9220C－1.7478，r=0.9999。1、2、3在0.2～2.0μg·mL-1范圍內線性關系良好。按標準曲線斜率法計算2、3的校正因子，分別為0.95、2.8。

2.3.5精密度

（1）進樣精密度：取“2.2”項下的對照溶液10μL，進樣5次，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD為1.5%。進樣精密度良好。

（2）重復性：取1原料藥10mg，置10mL量瓶中，精密量取“2.3.3”項下的2、3對照品貯備液1mL，同法配制6份供試品溶液；按“2.2”項下配制對照溶液；分別進樣測定，計算2、3含量的RSD分別為1.8%、2.5%。方法的重復性良好。

（3）中間精密度：與重復性試驗于不同日期、不同人員、不同儀器，同法測得6個結果，與重復性試驗結果合并計算RSD為2.0%、2.8%。方法的中間精密度良好。

2.3.6準確度：取1原料藥10mg，9份，分別置10mL量瓶中，每3份為一組，每組分別精密加入“2.3.3”項下的2對照品貯備液0.5、1.0、1.5mL，精密加入3對照品貯備液0.2、0.4、0.6mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別進樣測定，計算得2和3的平均回收率（n=9）分別為98.3%和96.7%，RSD分別為2.3%和2.7%。方法的準確度良好。

2.3.7耐用性

（1）溶液穩定性：取系統適用性試驗溶液分別于0、2、4、8、16、24h依法測定，結果主峰面積RSD為0.52%，各雜質峰面積RSD均不大于10%，表明溶液在24h內穩定。

（2）色譜參數：在流速（±0.2mL/min）、波長（±2nm）、柱溫（± 5℃）、流動相初始比例（±1%）、色譜柱（不同批號）略有改變的條件下，分別取系統適用性試驗溶液、供試品溶液（加入各雜質貯備液使含量約為0.1%）、對照溶液進樣測定；在各條件下的系統適用性試驗溶液色譜圖最小分離度均不小于1.5；各條件下的各雜質含量數據（n=6）的RSD均不大于10%。方法的耐用性良好。

2.4樣品測定：取三批樣品（批號140801、140802、140803）分別按“2.2”項下配制供試品溶液，進樣測定，另取對照溶液、系統適用性試驗溶液同時測定，結果三批樣品中均未檢出2、4、5，檢出3的含量分別為0.05%、0.08%、0.06%。

3討論

波長的選擇：將1、2、3、4、5對照品貯備液分別進行波長掃描，結果表明在210nm波長處均有較大吸收，并參考FDA的審批報告披露信息［2］，選擇210nm作為檢測波長。

溶劑的選擇：1為酯類遇水容易水解，故溶劑采用乙腈、甲醇，但2、4用乙腈溶解后峰型分叉或拖尾，故最終選擇甲醇為溶劑。

［1］國家藥典委員會，中華人民共和國藥典［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅨA.

［2］FDA.Chemistry Review（s）［EB/OL］.［2014-06-15］.

Determination of Related Compound in Dimethyl Fumarate by HPLC

Deng Shuangbing1Shi Yan2Han Lin3Tu Tao3*（1.Shenzhen WanHe Pharmaceutical Co.，Ltd，Guangdong 518057，China；2.National Insitutes for Food and Drug Control，Beijing 100500，China；3.Beijing Bio-welcome Medical Technology CO.，Limited，Beijing100176，China）

Objective：The HPLC method was improved for the determination of the related compounds in dimethylfumarate.Method：A C18column was used；Used acetonitrile as mobile phase A，0.1%phosphoric acid as mobile phase B，and gradient eluted.The detection wavelength was 210nm.Results：The calibration curves for dimethyl fumarate and its related compounds A and B were linear in the range of 0.2～3μg·mL-1.The average recoveries of related compounds A and B were 98.3%（RSD=2.3%）and 96.7%（RSD=2.7%）.Conclusion：The specificity，accuracy，sensitivity，etc.meet the requirements for the determination of dimethyl fumarate related compound.

Dimethyl fumarate Related compound HPLC Determination

R927

A

1672-8351（2016）08-0006-02